Mutaciones de línea germinal del proto-oncogen ret en pacientes chilenos con cáncer medular tiroideo hereditario y esporádico Germline mutations of the ret proto- oncogen in Chilean patients with hereditary and sporadic medullary thyroid carcinoma Nelson Wohllk G, Pedro Becker C, Ronald Youlton R, Gilbert J Cote y Robert F Gagel

Correspondencia a: N Wohllk, Rancagua 835, Providencia. Santiago, Chile. email: iema@terra.cl

Background: Medullary thyroid carcinoma (MTC) may occur either as a sporadic or familial disease. Multiple endocrine neoplasia (MEN) type 2, inherited as an autosomal dominant disease, is characterized by MTC only (FMTC) or coexistence of MTC with other endocrine neoplasia (NEM 2A, 2B). Germline mutations of the RET proto-oncogene (cRet) are found in the inherited forms and in some apparently sporadic MTC cases. Aim: To study RET mutations in 8 families with MEN 2. Material and methods: RET mutations were screened in peripheral blood DNA from 18 patients and 87 high risk carriers belonging to 8 MEN 2 families and 52 sporadic MTC. Exons 10, 11, 13, 14, 15 and 16 of the c-Ret were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and examined by direct sequencing of PCR products and/or restriction enzyme analysis. Results: Five MEN 2A and one FMTC families with a germline mutation at codon 634, one MEN 2A and one FMTC family carrying a mutation at codon 620 were identified. Mutations were found in 23 out of 87 high risk carriers. In addition, we detected a S891A (exon 15) germline mutation in a sporadic MTC patient and in one out of her three sons and V804M (exon 14) in another sporadic MTC case and in one out of his six relatives, indicating in both cases the presence of a sporadic misclassified familial disease. Conclusions: These results underscore the importance of routine application of c-Ret testing in all cases of MTC either familial or sporadic. (Rev Méd Chile 2001; 129: 713-8).
(Key-Words: Multiple endocrine neoplasia Type 2; Proto-oncogene proteins; Thyroid neoplasms)

Recibido el 19 de abril, 2001. Aceptado en versión corregida el 24 de mayo, 2001.
Trabajo financiado por proyecto FONDECYT #1980135.
Sección de Endocrinología, Departamento de Medicina, Hospital del Salvador y Laboratorio
IEMA, Santiago de Chile. Clínica Las Condes, Santiago de Chile y Sección Endocrinología
MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, USA.

El cáncer medular del tiroides (CMT) se produce a partir de las células C (o parafoliculares), y representa el 5-10% de todos los cánceres tiroideos. El CMT se presenta en forma esporádica (75%) o en el 25% restante como un componente del síndrome familiar denominado neoplasia endocrina múltiple tipo 2 (NEM 2)¹; éste se transmite en forma autosómica, existiendo 3 variedades: NEM 2A se caracteriza por CMT, feocromocitoma e hiperparatiroidismo. La segunda forma clínica denominada NEM 2B es la asociación de CMT, feocromocitoma, neuromatosis gastrointestinal, hábito marfanoide y ausencia de enfermedad paratiroidea². La tercera forma es la aparición exclusiva de cáncer medular tiroideo en varios miembros de una familia (CMT familiar⁾³.

En más del 95% de pacientes con NEM 2A y CMT familiar, se han identificado mutaciones de línea germinal del proto-oncogen ret (c-ret) las cuales afectan una de las tantas cisteínas ubicadas en la porción extracelular, codificadas por los exones 10 (codones 609, 611, 618, 620) y 11 (codones 630 y 634)^4-6. En el caso de NEM 2B la mutación afecta a la región catalítica del dominio tirosina kinasa (exón 16, codón 918) en más del 97%⁷. Además se han descrito otras 4 mutaciones de muy baja frecuencia (<1%) ubicadas en los exones 13 (codones 768, 790, 791), exón 14 (codón 804) y exón 15 (codón 891) especialmente en CMT familiar^8-11.

La detección de mutaciones de c-ret en familias con NEM 2 permite el diagnóstico y tratamiento precoz (mediante la tiroidectomía profiláctica) de los familiares del caso índice, lo cual ha sido confirmado por varios grupos; también es más adecuado, en un análisis costo-beneficio en comparación a la medición seriada de calcitonina basal o estimulada con pentagastrina^12-14.

Las NEM 2 y los CMT esporádicos pueden tener una presentación clínica indistinguible al inicio. Aún más, un paciente con CMT puede ser considerado erróneamente como caso esporádico ya sea porque la historia familiar es incompleta o desconocida, por la aparición de mutaciones de novo o por ser una enfermedad de curso más bien leve¹⁵. El estudio genético permite diferenciar con alta seguridad ambas entidades.

El objetivo de este trabajo es presentar nuestra experiencia en el estudio genético de c-ret en 8 familias portadoras de NEM 2 y en 52 individuos a los que se le había diagnosticado un CMT supuestamente esporádico.

MATERIAL Y MÉTODO

Pacientes. El estudio incluyó a 8 familias con NEM 2, 6 tenían NEM 2A y 2 CMT familiar. En total estudiamos a 18 pacientes con diagnóstico de NEM 2A o CMT familiar y a 87 familiares directos, en riesgo de presentar la enfermedad. Las características clínicas de los pacientes se presentan en la Tabla 1. La familia F1 presentó además la variante muy poco frecuente denominada amiloidosis cutánea liquenificada (ACL)¹⁶. El cuadro clínico de la familia F2 fue comunicado previamente¹⁷. Además se evaluaron 52 pacientes con CMT considerados como esporádicos ya que la historia familiar, características clínicas y los exámenes bioquímicos y de imágenes no revelaron evidencia de NEM 2A, 2B o CMT familiar. El estudio fue aprobado por el comité de ética de nuestro hospital y todos los pacientes incluidos, dieron su aprobación mediante consentimiento escrito.

Muestra de ADN. El ADN se aisló de muestra de sangre periférica de acuerdo al método de Lahiri, usando DNAzol® (GibcoBRL)¹⁸. Los exones 10, 11, 13, 14, 15 y 16 de c-ret fueron amplificados por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Las condiciones de amplificación usadas han sido descritas previamente^9,15. Se utilizaron los siguientes partidores:

exón 10, 7F 5´GCGCCCCAGGAGGCTGAGTG 3´
000000 y 7R 5´CGTGGTGGTCCCGGCCGCC 3´

exón 11, 11IF 5´GACACGGCAGGCTGGAGAGC 3´
000000y 11ER 5´CACCGAGACGATGAAGGAGA 3´

exón 13, 13F2 5´CTCTCTGTCTGAACTTGGGC 3´
000000 y 13IR 5´AGAACAGGGCTGTATGGAGC 3´

exón 14, 14F 5´AAGACCCAAGCTGCCTGAC 3´
000000 y 14IR 5´GCTGGGTGCAGAGCCATAT 3´

exón 15, 15F 5´GTGACCGCTGCCTGGCCATGG 3´
000000 y 15R 5´CCTAGGCTTCCCAAGGACTGCCTGC

exón 16, fRet16 5´AGGGATAGGGCCTGGGCTTC
000000 y 16R 5´TAACCTCCACCCCAAGAGAG 3´

La secuenciación directa de los productos de PCR se realizó usando un método modificado del protocolo del kit thermosequenase radiolabeled terminator cycle sequencing kit® (USB Corporation)19. Todas las mutaciones fueron confirmadas en una segunda muestra mediante restricción (Tabla 2, revisado en ref. 20) o por repetición de la secuenciación (exones 14 y 15). En cada amplificación y restricción enzimática se utilizaron controles positivos y negativos para asegurar la actividad de las enzimas de restricción usadas.

RESULTADOS

En la Tabla 2 se muestra un resumen de los resultados. En todos los pacientes con NEM 2A y CMT familiar se identificaron mutaciones las cuales se ubicaron en los exones 10 y 11. Mutaciones en el exón 11 codón 634 fueron las más frecuentes (6/8). En la familia F1 con la variante ACL, se encontró la mutación 634 TGC®TGG. De los 87 familiares de casos de NEM 2A o CMT familiar, y sin evidencia clínica de enfermedad, el estudio genético demostró que 23 tenían la mutación. En 19 de los 23 portadores, se realizó consejo genético; de éstos, en 13 sus padres o los pacientes aceptaron la tiroidectomía profiláctica, encontrándose en todos ellos Hiperplasia de células C (HCC) y/o CMT, destacando una niña de 3 años en la cual se encontraron varios focos microscópicos de CMT.

Del grupo esporádico, en 50 pacientes no se encontraron mutaciones de línea germinal en los exones 10, 11, 13, 14, 15 y 16 lo cual confirma con alta seguridad que efectivamente se trataban de CMT esporádicos. Este hallazgo permitió que 400 familiares de estos 50 pacientes fueran eximidos de mayor estudio. En los otros 2 casos de CMT supuestamente esporádicos se detectaron las siguientes mutaciones: en una paciente de 49 años encontramos la rara mutación Ser 891 Ala (TCG®GCG) en el exón 15 (Figura 1, panel A). El análisis de c-Ret en los 3 familiares evaluados mostró la misma mutación en una hija de 24 años. En ella, el test de calcitonina estimulada con pentagastrina fue positivo, por lo que se indicó la tiroidectomía total; la inmunohistoquímica confirmó CMT microscópico y HCC. El otro paciente de 47 años presentó una mutación de muy baja frecuencia, ubicada en el exón 14 Val 804 Met (GTG®ATG) (Figura 1, panel B). El estudio genético en 6 familiares reveló la misma mutación en un hijo de 16 años y en el cual decidimos no indicar la tiroidectomía ya que el test de pentagastrina fue normal. Ambas familias fueron clasificadas entonces como NEM 2 variedad CMT familiar pues el estudio no ha demostrado hasta ahora la presencia de feocromocitoma o hiperparatiroidismo.

Figura 1. Secuenciación de c-Ret en 2 pacientes con CMT esporádico y en un individuo normal. Las letras inferiores corresponden a los nucleótidos Guanina (G), Adenina (A), Timina (T) y Citosina (C). Las secuencias se leen de abajo hacia arriba en la dirección 5’®3’. Ambas figuras muestran los nucleótidos relevantes de las secuencias (señalados por círculos llenos), los aminoácidos antes y después de la mutación y los codones donde se ubican las mutaciones: panel A exón 15, panel B exón 14.

DISCUSIÓN

Usando métodos de secuenciación directa y de restricción enzimática identificamos mutaciones del proto-oncogen ret en los 18 pacientes pertenecientes a las 8 familias chilenas con NEM 2. El tipo de mutaciones encontradas fue muy similar a las publicadas previamente, siendo las más frecuentes, aquellas ubicadas en el exón 11, codon 634^4-6,21. Aunque las mutaciones del codón 634 se asocian más frecuentemente a NEM 2A, familias con NEM 2 variedad CMT familiar pueden también presentar mutaciones en dicho codón, siendo más frecuente las de TGC®TAC, hallazgo encontrado en la familia F621. Un hecho interesante fue la mutación encontrada en la familia con la varieda ACL; todas las mutaciones publicadas en esta variedad se han encontrado en el exón 11 codón 634, sin embargo, la mutación encontrada en nuestra familia estudiada (TGC®TGG) no ha sido descrita previamente. Debido a que solo unas pocas familias han sido publicadas, la nuestra podría ser agregada a la base de datos de NEM 2A/ACL^6,16,21,22. En lo que respecta al manejo de los portadores asintomáticos de la mutación de los exones 10 y 11, los 13 individuos operados profilácticamente presentaron HCC y/o CMT (resultados presentados parcialmente en ref. 23), confirmando la seguridad del test genético y la precocidad con la cual se debe indicar la cirugía^12-14. En los otros 64 individuos con riesgo de presentar la enfermedad, el test genético no evidenció la mutación, permitiendo excluirlos de mayor estudio con el consiguiente ahorro de recursos en búsqueda de las otras manifestaciones de la enfermedad.

La necesidad de buscar mutaciones de línea germinal en individuos con CMT esporádicos ha sido revisada en distintas publicaciones^6,15,21. En grupos de pacientes con CMT esporádico no seleccionados, se ha encontrado que hasta 6% de ellos presentan mutaciones de línea germinal, lo cual se podría explicar por una historia familiar incompleta, aparición de mutaciones de novo o formas familiares de expresión tardía y leves^15,24,25. Luego de realizar el estudio genético en nuestro grupo de pacientes con CMT supuestamente esporádicos, encontramos que el 4% (2/52) correspondieron a NEM 2 variedad CMT familiar ya que ambos pacientes y algunos de sus familiares presentaron la mutación de línea germinal y no se encontró hiperparatiroidismo o feocromocitoma. La historia familiar negativa en estos casos se podría explicar porque las mutaciones encontradas (exón 14 codón 804 y exón 15 codón 891) corresponden, de acuerdo a la literatura, a una enfermedad de baja penetrancia, de curso más bien leve y localizada sólo en el tiroides^6,8,10,11,25. A diferencia de lo que ocurre para las mutaciones de los exones 10 y 11, la sola presencia de mutaciones en los exones 14 y 15 no fue razón suficiente para indicar la tiroidectomía profiláctica en los hijos de ambos pacientes. La información internacional respecto a la edad en la cual se debe indicar la tiroidectomía profiláctica en este grupo de mutaciones es escasa y discutible^24,25. En la hija de uno de los pacientes (mutación en el exón 15), la cirugía se indicó como consecuencia de una prueba de pentagastrina francamente positivo. En el hijo del paciente con la mutación en el exón 14 V804M (GTG®ATG), la decisión de indicar la cirugía ha sido más difícil, ya que por una parte, un grupo de investigadores postulan que por ser la enfermedad de curso más bien leve, estos individuos deberían ser operados alrededor de los 20 años^10,25; mientras que otros sostienen que la enfermedad debería manejarse en forma más precoz²⁴. Después de comprobar ausencia de nódulo tiroideo a la ultrasonografía y una prueba de pentagastrina normal, decidimos mantenerlo en observación, esperando que exista mayor consenso en el manejo de este tipo específico de mutaciones.

El estudio genético permitió excluir de mayor estudio a aproximadamente 400 familiares directos de los 50 pacientes en los cuales el diagnóstico molecular confirmó el CMT esporádico, ya que se analizaron los exones en donde se ubican la totalidad de las mutaciones descritas hasta la fecha, con el consiguiente ahorro de recursos en los distintos exámenes que se hubiesen tenido que realizar en caso de no haber contado con el análisis genético (calcitonina, catecolaminas urinarias, PTH, calcemia, fosfemia, exámenes de imágenes).

En suma nuestros resultados confirman la importancia de realizar estudio genético de c-ret tanto en los individuos en riesgo de presentar la enfermedad por el hecho de ser familiares de pacientes con NEM 2, así como en todo individuo con CMT por muy esporádico que parezca.

REFERENCIAS

1. Wohllk N, Becker P, Véliz J, Pineda G. Neoplasias endocrinas múltiples: un modelo clínico para aplicar técnicas de genética molecular. Rev Méd Chile 2000; 128: 791-800.

2. Carney JA, Sizemore W, Hayles AB. Multiple endocrine neoplasia type 2b. Pathobiol Annu 1978; 8: 105-53.

3. Farndon JR, Leight S, Dilley WG, Baylin SB, Smallridge RC, Harrison TS et al. Familial medullary thryoid carcinoma without associated endocrinopathies: a distinct clinical entity. Br J Surg 1986; 73: 278-81.

4. Mulligan LM, Kwok JBL, Healey C, Elsdon MJ, Eng C, Gardner E et al. Germ-line mutations of the RET proto-oncogene in multiple endocrine neoplasia type 2A. Nature 1993; 363: 458-60.

5. Donis-Keller H, Shenshen D, Chi D, Carlson KM, Toshima K, Lairmore TC et al. Mutations in the Ret proto-oncogene are associated with MEN 2A and FMTC. Hum Mol Genet 1993; 2: 851-6.

6. Eng C, Mulligan LM. Mutations of the RET Proto-Oncogene in the Multiple Endocrine Neoplasia Type 2 Syndromes, Related Sporadic Tumours and Hirschsprung Disease. Hum Mutat 1997; 9: 97-109.

7. Hofstra RMW, Landsvater RM, Ceccherini I, Stuip RP, Stelwagen T, Luo Y et al. A mutation in the RET proto-oncogene associated with multiple endocrine neoplasia type 2B and sporadic medullary thyroid carcinoma. Nature 1994; 367: 375-6.

8. Bolino A, Schuffenecker I, Luo Y, Seri M, Silengo M, Tocco et al. RET mutations in 13 and 14 of FMTC patients. Oncogene 1995; 10: 2415-9.

9. Berndt I, Reuter M, Saller B, Frank-Raue K, Groth P, Grubendorf M et al. A new hot spot for mutations in the ret proto-oncogene causing familial medullary thyroid carcinoma and multiple endocrine neoplasia type 2A. J Clin Endocrinol Metab 1998; 83: 770-4.

10. Fattoruso O, Quadro L, Libria, Lupoli G, Cascone E, Colantuoni V. A GTG to ATG novel point mutation at codon 804 in exon 14 of ret proto-oncogene in two families affected by familial medullary thyroid carcinoma. Hum Mutat 1998; Suppl 1(6): S167-71.

11. Hofstra R, Fattoruso O, Quadro L, Wu Y, Libroia A, Verga U et al. A novel point mutation in the intracellular domain of the ret proto-oncogene in a family with medullary thyroid carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 4176-8.

12. Gagel RF, Cote GJ, Martins Bugalho MJG, Boyd AE, Cummings T, Goepfert H et al. Clinical use of molecular information in the management of multiple endocrine neoplasia type 2A. J Int Med 1995; 238: 333-41.

13. Wells SA, Chi DD, Toshima K, Dehner LP, Coffin CM, Dowton B et al. Predictive DNA testing and prophylactic thyroidectomy in patients at risk for multiple endocrine neoplasia type 2A. Ann Surg 1994; 220: 237-50.

14. Lips CJ, Landsvater RM, Hoppener JW, Geerdink RA, Blijham G, Van Veen JM et al. Clinical screening as compared with DNA analysis in families with multiple endocrine neoplasia type 2A. N Engl J Med 1994; 331: 828-35.

15. Wohllk N, Cote GJ, Bugalho MMJ, Ordonez N, Evans DD, Goepfert H et al. Relevance of RET Proto-Oncogene Mutations in Sporadic Medullary Thyroid Carcinoma. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: 3740-5.

16. Gagel RF, Levy ML, Donovan DT, Alford BR, Wheeler T, Tschen JA. Multiple endocrine neoplasia type 2A associated with cutaneous lichen amyloidosis. Ann Intern Med 1989, 111: 802-6.

17. Campusano C, Cárdenas IE, Olea E, Bertin P. Neoplasia endocrina múltiple tipo 2A. Presentación de un caso de evolución inhabitualmente agresiva. Rev Méd Chile 1996; 124: 1100-6.

18. Lahiri D, Nurnberger J. A rapid non enzimatic method for the preparation of HMW DNA from blood for RFLP studies. J Nucleic Acid Res 1991; 19: 5444.

19. Khorana S, Gagel RF, Cote GJ. Direct sequencing of PCR products in agarose gel slices. Nucleic Acids Research 1994; 22: 3425-6.

20. Wohllk N, Cote GJ, Evans DB, Goepfert H, Ordonez NG, Gagel RF. Application of genetic screening information to the management of medullary thyroid carcinoma and multiple endocrine neoplasia type 2. Endocr Metab Clin North Am 1996; 25: 1-25.

21. Eng C, Clayton D, Schuffenecker I, Lenoir G, Cote G, Gagel RF et al. The relationship between specific RET proto-oncogene mutations and diseases phenotype in multiple endocrine neoplasia type 2A. JAMA 1996; 276: 1575-9.

22. Karga HJ, Karayianni MK, Linosdm, Tseleni SC, Karaiskos KD, Papapetrou PD. Germline mutation analysis in families with multiple endocrine neoplasia type 2A or familial medullary thyroid carcinoma. Eur J Endocrinoloy 1998; 139: 410-5.

23. Wohllk N, Becker P, Youlton R, Ojeda D, Cohn D, Pineda G. Therapeutic results of thyroidectomy in MEN 2 Ret gene carriers. Correlation between calcitonin values and tumor histopathology. Endocrine Journal 2000 (S); 47: 216.

24. Frohnauer MK, Decker RA. Update on the MEN 2A c804 RET mutations: Is prophylactic thyroidectomy indicated? Surgery 2000; 128: 1052-8.

25. Machens A, Gimm O, Hinze R, Hopnner W, Boehm B. Genotype-phenotype correlations in hereditary medullary thyroid carcinoma: Oncological features and biochemical properties. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 1104-9.

Agradecimientos:

A Leticia Madariaga y Maritza Bravo por el apoyo técnico. A los Drs. D Ojeda, D Cohn, C Reyes, R Wiener, T Vidal, J Sanz, E Arteaga por el aporte de las familias y a los endocrinólogos miembros de la Sociedad Chilena de Endocrinología y Metabolismo por el aporte de pacientes.