Rev Méd Chile 2003; 131: 412-418

 

Streptococci mutans: Método semi- cuantitativo para establecer el rango de riesgo de infección bucal en niños preescolares chilenos Alfredo Linossier C1, Alex Vargas D1, Gisela Zillmann G1, Moisés Arriagada R1, Robinson Rojas A1, Rodrigo Villegas R2. A semi-quantitative method to assess oral infections with Streptococci mutans in preschool Chilean children

 

 

 

 

 

 

 

Background: Salivary infection due to Streptococci mutans is considered the main microbiological risk factor for the initiation of dental caries. Aim: To evaluate a semi-quantitative method to assess Streptococci mutans salivary infection and compare it with the existing quantitative method. Patient and methods: Saliva samples were obtained from 650 pre-school children aged 2 to 6 years old using a TYCSB liquid medium for counting Streptococci mutans. Results were compared with quantitative cultures. Results: There was a 99.3% linear correlation coefficient between both methods. The correlation coefficients with dental caries prevalence were 97% for the semi quantitative method and 90% for the quantitative method. Conclusions: The semi-quantitative method to assess oral infection with Streptococci mutans, is accurate enough to be used in population studies and oral infection prevention programs in developing countries (Rev Méd Chile 2003; 131: 412-8).

(Key Words: Dental caries; Oral hygiene index; Streptococcus mutans)

Recibido el 22 de julio, 2002. Aceptado en versión corregida el 4 de marzo, 2003.
Trabajo financiado por GRANT FONDECYT # 1960842 y TWAS, BC 88-44.
Servicio de Odontología y Cirugía Máxilo Facial, Escuela de Medicina de la Pontificia Universidad
Católica de Chile.
Departamento de Patología, Facultad de Odontología y Departamento de Salud Pública, Escuela
de Medicina, Universidad de Chile.
¹Cirujano Dentista
²Bioestadístico

El grupo Streptococci mutans (incluido en el grupo Streptococci viridans)^1-3, ha sido descrito recientemente como un constituyente de la flora bacteriana oral del hombre desde hace miles de años⁴. Este grupo incluye al Streptococcus mutans, que es uno de los principales agentes responsables de la caries del esmalte dental^5,6.

En niños, la colonización temprana y la infección por Streptococcus mutans es un factor clave en el riesgo de desarrollo de caries especialmente en países en vías de desarrollo, donde estas lesiones tienen una alta prevalencia^7,8.

Es posible estimar a través de técnicas microbiológicas, como son los métodos cuantitativos y semi-cuantitativos, rangos de infección por Streptococcus mutans y relacionarla con el desarrollo de caries dental^9-11.

En este estudio, validamos un método semi-cuantitativo a través de la medición del rango de infección por Streptococci mutans en saliva, en niños preescolares entre 2 y 6 años, usando un medio de cultivo líquido TYCBS (T= casitone; Y= extracto de levadura; C= cistina; S= sacarosa; B= bacitracina).

Material y método

Población en estudio: Este estudio fue llevado a cabo en 650 niños de los Centros Abiertos de la Ilustre Municipalidad de Santiago de Chile (350 varones y 300 mujeres) con edades entre 2 y 6 años.

Cada grupo fue sometido a un examen clínico oral, donde se evaluó la historia de caries de acuerdo a los estándares OMS¹² a través del coed (dientes cariados obturados y exfoliados).

Los resultados fueron registrados en una ficha clínica precodificada, incluyendo datos clínicos, microbiológicos, bioquímicos y serológicos.

Estudio microbiológico: Los niveles basales de se determinaron en muestras de saliva (0,5-1 ml) obtenidas dos horas después del desayuno (sin cepillado dental previo). La secreción salival fue estimulada por la masticación de un trozo de parafina sólida (0,9 gramos) durante dos minutos.

Método cuantitativo: Las muestras de saliva (0,5-1 ml) fueron colectadas en un tubo de vidrio con la ayuda de un embudo de vidrio y guardada por una hora a 0°C para el análisis microbiológico¹³.

Posteriormente fueron agitadas por un mezclador (Max Mix II type 37600 Mixer), durante 60 s. Luego, 100 µL de saliva fueron agregados a 900 µL de una solución tampón de fosfato de 0,2 M (pH 7,4).

La solución resultante fue nuevamente homogeneizada por sonicación durante 2 min a 37°C y un volumen de 100 µL fue sembrado en una placa de Petri con agar TYCSB¹⁴.

Se incubaron utilizando un sistema de anaerobiosis (jarras Gas-Pack) con una mezcla de 95% N₂, 5% CO₂, durante 48 h a 37°C.

Las colonias fueron contabilizadas de acuerdo al método descrito por Westergreen y Krasse¹². Se construyeron 4 rangos de colonias según cuartiles (3,0-4,9; 5,0-5,5; 5,6-6,0; 6,1-7,5. Log UFC/ml saliva Streptococci mutans) para hacer comparables estos recuentos con los rangos del método semi-cuantitativo.

Método semi-cuantitativo: Las muestras de saliva fueron obtenidas desde el vestíbulo labial inferior por medio de una espátula de plástico e inoculadas en caldo TYCSB selectivo para Streptococci mutans, y rojo neutro. Posteriormente se incubaron por 48 h a 37°C, en condiciones aeróbicas.

Las colonias adherentes de Streptococci mutans fueron observadas por transiluminación en un lente de magnificación de Spencer.

Cada muestra fue asignada de uno a cuatro rangos: 0: <10⁴; 1: 10⁴ ≤10⁵; 2: 10⁵ ≤10⁶ y 3: ≥10⁶ UFC/mL saliva¹⁵.

Estudio bioquímico: Para identificar colonias, a través del análisis bioquímico, dos de estas colonias fueron incubadas por 18 h en un medio de cultivo líquido Todd Hewitt, y las bacterias desarrolladas fueron centrifugadas a 5.000 rpm por 5 min.

El material obtenido fue diluido en una solución tampón de fosfato (pH 7,4) a una concentración N°5 de MacFarland (1,5 x 109 CFU/mL)¹⁶. Esta suspensión fue usada para identificar biotipos de Streptococci mutans a través del siguiente micrométodo:

En un rectángulo de vidrio de 11,5 x 8 cm, dividido en 48 pocillos de 0,8 cm de diámetro cada uno, fueron colocadas separadamente 30 µL de diferentes azúcares, a una concentración del 1%, diluidos en caldo de thioglycolato sin dextrosa y sin indicador de pH (manitol, sorbitol, sacarosa, melibiosa, rafinosa y almidón). Para determinar la sensibilidad a la bacitracina se utilizaron 0,2 unidades de bacitracina/ml, arginina y esculina^17,18. El rectángulo de vidrio fue colocado en una caja plástica estéril y cultivada en una cámara de cultivo celular durante 18 h.

Estudio serológico: El antisuero fue preparado en conejos hembras inmunizadas con S mutans (Ingbritt, serotipo c) o S sobrinus (OMZ 176 serotipo d), de acuerdo a la técnica de inmunodifusión doble descrita por Ouchterlony^19,20.

Análisis estadístico: Los resultados fueron analizados usando la prueba de ANOVA, considerándose significativos aquellos valores que presentaron un p <0,05 y "t" de Student para datos no pareados, utilizando 2 colas y estimando como significativos aquellos valores con un p <0,05.

Para correlacionar el número de caries con la cuantificación salival de Streptococci mutans se utilizó el método del valor predictivo, dado por la sensibilidad y la especificidad de la prueba²¹.

Resultados

El grupo fue aislado en las muestras de saliva obtenidas de los 650 preescolares mostrando clínicamente la presencia de caries dental (con edades de 2 a 6 años), se encontró 99,3% de correlación (r=0,9965) entre ambos métodos cuantitativo y semi-cuantitativo (Figura 1).

La historia de caries para el grupo de niños se estableció a través del ceod. Este fue de 4,5±0,2, con un promedio de caries de 3,9±0,1, de un total de 20 piezas temporales (8 molares, 12 incisivos). A partir de este promedio, se separaron dos grupos: uno con menos de 4 caries y otro con más de 4 de caries.

Figura 1. Correlación entre los métodos cuantitativo (Log UFC/mL saliva) y semicuantitativo (rango 0, 1, 2, 3; UFC/mL saliva) para Streptococci mutans en saliva.
Los valores en el eje de las X, indican los rangos, para:
0: <10⁴
1: 10⁴ £10⁵
2: 10⁵ £10⁶
3: ³10⁶ UFC/ml de saliva
Cada valor es el promedio ± ESM (error estándar de las medianas) de los niños

Se comparó el promedio de caries con ambos métodos microbiológicos, encontrándose 97% y 90% de correlación usando los métodos cuantitativos (r=0,9877; Figura 2) y semi cuantitativo (r=0,9512; Figura 3), respectivamente.

Los límites de detección variaron de acuerdo a las metodologías microbiológicas utilizadas en la cuantificación del Streptococci mutans. Así tenemos que, cuando el valor fue inferior al log 3 (valor obtenido en 135 niños) para el método cuantitativo o, menor de 104 (en 115 niños) en el método semi-cuantitativo, estos antecedentes no fueron considerados en el análisis de los datos mostrados en ambas figuras.

Figura 2. Análisis de regresión lineal entre caries dental y el método cuantitativo para Streptococci mutans.
El eje de las X muestra los valores de los rangos obtenidos por Log UFC/streptococci mutans/mL en saliva de acuerdo a la metodología cuantitativa, en la cual:
3,0-4,9
5,0-5,5
5,6-6,0
6,1-7,5 UFC/mL de saliva
Cada valor es el promedio ± ESM de los niños.

Figura 3. Análisis de regresión lineal entre caries dental y el método semicuantitativo. Los valores en el eje de las X indican los rangos de la metodología semi-cuantitativa para la cual:

0: <10⁴
1: 10⁴ £10⁵
2: 10⁵ £10⁶
3: ³10⁶
Cada valor es el promedio ± ESM de los niños.

Al contrastar las metodologías cuantitativa y semi-cuantitativa utilizadas a nivel poblacional, se obtuvieron los siguientes valores: para el método cuantitativo la sensibilidad fue 78,53% (267/340) y la especificidad 46,77% (145/311), mientras que para el semi-cuantitativo la sensibilidad fue 80% (276/343) y la especificidad 50% (154/307) (Tablas 1 y 2).

Los estudios bioquímicos demostraron los biotipos más prevalentes, siendo el biotipo I el mayormente aislado, con 84%. El 6% correspondió al biotipo IV y otros. Un rango similar se obtuvo cuando se estudiaron los serotipos c (c, e, f) 80% y d (d, g, h) 4%.

Discusión

El grupo de microorganismos Streptococci mutans tiene un rol preponderante tanto en el inicio de la caries del esmalte que afectan a los dientes, como también en la caries que afecta la superficie de la raíz del diente en el adulto⁶.

Se han descrito diversos métodos para cultivar y cuantificar al grupo de Streptococci mutans, tanto en placa bacteriana como en saliva^{11,13,15,22-29}.

En este estudio se valida un método semi-cuantitativo para Streptococci mutans en saliva en niños preescolares, usando caldo TYCBS. Como gold standard de control se utilizó el recuento cuantitativo de Westergreen G y Krasse B¹⁵.

Nuestros resultados mostraron una fuerte correlación entre los métodos cuantitativo y semi-cuantitativo, con un r=0,9965. Cuando el número de caries se analizó separadamente con cada método la correlación fue de r=0,9877 para el método cuantitativo y de r=0,9512 para el semi-cuantitativo. Estos hallazgos sugieren que ambos métodos son de utilidad para establecer el rango de riesgo a la infección bucal.

Al comparar ambos métodos, en relación con el comportamiento en la población estudiada, los valores encontrados fueron similares, lo que sugiere que el método semi-cuantitativo es predictivo para detectar la presencia de caries en la población.

En general, la ausencia de Streptococci mutans parece ser un fuerte indicador de tener un bajo riesgo a caries dental (especificidad). Por el contrario, ante un alta cantidad de ellos el riesgo es mayor (sensibilidad)³⁰.

En relación con otros métodos semi-cuantitativos, como Cariescreen â y Dentocult â, se puede señalar que estos poseen un bajo grado de sensibilidad pero una especificidad relativamente alta, por lo tanto tienen un bajo valor predictivo de caries, aunque son eficaces en predecir un bajo riesgo de desarrollo de la enfermedad³¹.

Tal vez, esto se deba al medio de cultivo utilizado en los métodos anteriormente señalados. En ellos se utiliza mitis salivarius como medio selectivo para Streptococci mutans, mientras que nosotros usamos TYCSB, el cual es significativamente más sensible para la cuantificación de Streptococci mutans en relación con el mitis salivarius¹⁴.

Estudios teóricos han sugerido que la suma de la sensibilidad y especificidad debe tener un valor de al menos 160% de precisión para dar la seguridad de ser un buen predictor^32,33. En nuestros estudios, la suma de los valores de ambos métodos mostraron un total de 130%, estableciendo un moderado valor predictivo al dicotomizar los métodos con respecto al diagnóstico clínico de caries dental y nivel de infección.

Cabe mencionar que, dado que la caries dental es una enfermedad infecciosa, transmisible y multifactorial, debemos enfatizar que éste no es un método de diagnóstico, sino que sólo representa un valor predictivo de riesgo a caries dental.

Hay que tener presente, que el rango de infección basal permanece constante en el tiempo, el cual puede variar por acción de la dieta, cepillado dental, uso de antisépticos, antibióticos, etc.

Las ventajas de este método semi-cuantitativo son: no es invasivo, es simple, no es necesario tener un ambiente de anaerobiosis ni tampoco hacer diluciones de saliva como en el método cuantitativo. La bacitracina es parte del medio de cultivo (TYCBS) y el medio de cultivo puede guardarse refrigerado por varios meses, siendo más económico que otros sistemas existentes en el mercado.

Los criterios de validación para el S mutans, a través de pruebas bioquímicas y serológicas, evidenciaron que el biotipo I o serotipo c (c, e, f) del S mutans y biotipo IV o serotipo d (d, g, h) de S sobrinus fueron los biotipos y serotipos más prevalentes. Estos resultados son coincidentes con otros artículos de estudios en humanos donde el serotipo c es el más aislado, con algunas variaciones en las poblaciones estudiadas⁶.

Por lo tanto, el serotipo c tiene una alta prevalencia, por lo que tiene mayor probabilidad de transmisión a través de la saliva en la población. Por esta característica podría servir para el control de caries dental en el humano, a través de la aplicación de técnicas de inmunización activa o pasiva. Además, la estructura antigénica del S mutans ha sido muy estable en el tiempo, como fue demostrada por Linossier y col⁴.

Este método semi-cuantitativo serviría para establecer el estado de infección oral a nivel poblacional. Dado que el mecanismo de transmisión natural se produce a través de la saliva de padres a hijos es conveniente considerar el realizar el estudio a nivel familiar y extra familiar^34,35. Otro factor a considerar sería la oportunidad en que se aplique el método, ya que para efectos de protección de la dentadura definitiva debería hacerse a edades tempranas.

Otra utilidad que tendría esta técnica microbiológica es que serviría para el seguimiento del nivel de infección salival de Streptococci mutans pre y post tratamientos odontológicos, efectuándose a los pacientes en clínicas dentales varias determinaciones en períodos predeterminados.

El uso de esta metodología semi-cuantitativa permitiría hacer tamizajes poblacionales más extensos para establecer un valor predictivo de riesgo de caries dental, siendo ésta una herramienta de mucha utilidad en programas preventivos de salud oral.

El mayor rendimiento se obtendría aplicándolo en el ámbito de población preescolar, permitiendo actuar oportunamente en el control de la caries dental.

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Agradecimientos

Estamos agradecidos de los comentarios y sugerencias del Dr. Philip Marsh de la Universidad de Leed y del Dr. Carlos Valenzuela, quien amablemente revisó este manuscrito.

Correspondencia a: Dr. Alfredo Linossier C. Teléfonos: (56-2) 5235062-4427128. E mail: alinossi@terra.cl