Rev Méd Chile 2006; 134: 1107-1115

Artículo de Investigación

 

Variantes alélicas de CYP1A1 y GSTM1 como biomarcadores de susceptibilidad a cáncer gástrico: influencia de los hábitos tabáquico y alcohólico

Cytochrome P4501A1 (CYP1A1), glutathione S transferase M1 (GSTM1) polymorphisms and their association with smoking and alcohol consumption as gastric cancer susceptibility biomarkers

 

Kuen Lee^1,4, Dante Cáceres^2a, Nelson Varela^1b, Atila Csendes D³, Horacio Ríos R⁴, Luis Quiñones S^1c.

¹Laboratorio de Carcinogénesis Química y Farmacogenética, Programa de Farmacología Molecular y Clínica, ICBM y ²División de Epidemiología, Escuela de Salud Pública, Facultad de Medicina. ³Departamento de Cirugía, Hospital Clínico, Universidad de Chile. ⁴Universidad de los Andes, Departamento de Cirugía, Hospital Militar de Santiago.
^aMédico Veterinario, Magíster en Salud Pública.
^bTecnólogo Médico, Magíster en Bioquímica, Estudiante de Doctorado.
^cBioquímico, Doctor en Ciencias Biomédicas.

Dirección para correspondencia

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Background: Gastric cancer (GaC) is the second cause of death by cancer in the world and one of the first causes in Chile. However, the burden of this disease shows remarkable worldwide variation probably explained by environmental and genetic factors. The role of susceptibility low penetrance genes and environmental and dietary factors in the etiology of gastric cancer is not well-known. Aim: To analyze the possible association between CaG susceptibility, genetic (CYP1A1 and GSTM1 polymorphisms) and environmental (tobacco and alcohol) factors. Patients and Methods: In a case-control study, we included 73 patients with a pathologically diagnosed GaC and 263 controls. DNA was extracted from peripheral blood to detect allele variants for CYP1A1 and GSTM1, using polymerase chain reactions and digestion with restriction enzymes. Results: There was a clear association of smoking and alcohol ingestion with GaC with odds ratios (OR) of 2.54 (95% confidence intervals (CI) of 1.45-4.46 and OR of 3.36 (95% CI 1.76-6.41), respectively. Polymorphic variants of CYP1A1 and GSTM1 had no association with GaC. However, the m2 variant of CYP1A1 significantly modifies the risk induced by tobacco or alcohol (OR 13.65; 95% CI 3.15-59.05 y 8.37; 95% CI 1.86-37.64, respectively). Conclusions: Subjects that carry the m2 allelic variant of CYP1A1 and are exposed to tobacco smoke or alcohol have a significantly higher risk of developing gastric cancer.

(Key words: Alcohol consumption; Cytochrome P-450 CYP1A1; Smoking; Stomach neoplasms)

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El cáncer gástrico (CaG) es uno de los cánceres más frecuentes después del cáncer de colon y la segunda causa de muerte en el mundo después del cáncer pulmonar, correspondiendo aproximadamente a 10% de todos los cánceres^1,2. Afecta indistintamente a ambos sexos, con tasas inferiores en el sexo femenino en todas las edades y rara vez ocurre antes de los 50 años de edad, con excepción de Japón. Sin embargo, en las últimas décadas ha habido importantes variaciones, apareciendo cada vez con mayor frecuencia en pacientes más jóvenes, incluso menores de 40 años. Entre los factores reconocidos de riesgo, figuran la gastritis crónica atrófica con metaplasia intestinal, la infección por Helicobacter pylori, las dietas ricas en alimentos salados, ahumados o secos, el tabaquismo, la anemia perniciosa, la enfermedad de Menetrier, la poliposis familiar, el sexo masculino y la edad avanzada^3-5.

La incidencia de cáncer gástrico en Chile es una de las más altas del mundo, junto con Japón, Costa Rica y Singapur. Aun cuando la tasa de mortalidad por esta causa ha disminuido desde la década 1960-69 a la fecha (35,8 a 18,94 por 100.000 habitantes), Chile aún presenta una elevada tasa de esta patología, especialmente en la región de la Araucanía^6,7. De acuerdo a Medina y Kaempffer (2001), la probabilidad media de que un chileno muera por cáncer de estómago es de alrededor de 3%, transformando a esta enfermedad en un problema de salud pública importante⁸.

El papel de los factores genéticos ha sido ampliamente estudiado en la etiología del CaG. Estos últimos explicarían una variabilidad de un orden de 10 veces, dependiendo del área geográfica involucrada³. Estudios de agregación familiar, han determinado un rango de 50 a 130% de exceso de riesgo en individuos con historia familiar de cáncer gástrico, especialmente con el antecedente materno, así como factores hereditarios de cáncer colorrectal y síndrome de Li-Fraumeni^9,10. Sin embargo, se requiere cautela en estos análisis, ya que se ha descrito sesgos de selección e información^11,12.

Diferentes polimorfismos genéticos en enzimas de biotransformación han sido investigados, entre ellos algunos relacionados con grupos sanguíneos, citoquinas y algunos alelos asociados a la presencia de Helicobacter pylori^13-18. Entre las isoenzimas más estudiadas con relación a cáncer, se encuentran las de fase 1 monooxigenasas citocromo P450 (CYP2D6, CYP2C19, CYP17 y CYP1A1), involucradas en la biotransformación de xenobióticos tales como: hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), nitrosaminas y dioxinas, como las que se encuentran en el humo del tabaco¹⁹ y las de fase 2 glutatión transferasa (GST), entre las que destacan las GSTM1(GSTmu) y GSTT1(GSTpi) involucradas en la desintoxicación de compuestos potencialmente carcinogénicos^20-25.

Recientemente, se ha planteado la hipótesis que CYP1A1 sería activada en etapas tempranas del proceso gastro-carcinogénico a través de procesos oncogénicos, indicando que sería un paso crítico necesario, en el largo plazo, para la bioactivación de factores carcinogénicos, que producirían alteraciones genéticas en las células impactadas^26-28. Por lo tanto, la expresión de CYP1A1 puede ser un importante factor de riesgo en individuos expuestos a xenobióticos presentes en humo de tabaco. Por otra parte, GSTM1 metaboliza estos carcinógenos ambientales activándolos y conjugándolos, por lo tanto, las variantes polimórficas de esta enzima pueden estar asociadas a un riesgo aumentado de cáncer gástrico²⁹. A su vez, se ha propuesto que el consumo de alcohol induciría y suprimiría genes responsables del metabolismos de xenobióticos como los HAPs incrementando la formación de aductos a nivel del ADN^30-32.

A pesar de la evidencia de expresión de enzimas citocromo P450 en la metaplasia gástrica intestinal y en el adenocarcinoma gástrico, así como estudios en japoneses y chinos que han asociado el genotipo nulo M1 de GST con cáncer gástrico, no existen antecedentes a nivel nacional respecto de polimorfismos en estos genes y de su asociación con riesgo de cáncer gástrico^27,33-35. En este estudio proponemos evaluar la posible interacción de polimorfismos en enzimas de metabolización de xenobióticos GSTM1 y CYP1A1, con la exposición a alcohol y tabaco y la relación de esta interacción con el riesgo de cáncer gástrico.

Pacientes y métodos

Pacientes y toma de muestras. Se realizó un estudio de base hospitalaria con 73 casos con cáncer gástrico histológicamente determinado y 263 controles, pesquisados de los Servicios de Gastroenterología del Hospital Militar, J.J. Aguirre y San Borja Arriarán. La edad promedio de ambos grupos fue similar (p =0,06), siendo para el grupo control de 62,50±13,5 (22-91) y para los casos de 66,034 ± 13,4 (39-94). El 68% de los casos y 78% de los controles eran de sexo masculino, siendo esta diferencia estadísticamente significativa (p <0,05).

La evaluación de los pacientes y controles incluyó ficha clínica con datos personales, grupo sanguíneo, hábito de fumar, consumo de alcohol y antecedentes de morbilidad personal y familiar. Se consideró bebedores a aquellas personas que ingieren regularmente el equivalente a un promedio superior a dos copas de vino al día (400 ml). Para la definición del hábito tabáquico se consideró fumador a aquellas personas con un SI (Smoking Index o índice de Brinkman) mayor o igual a 801³⁶ (cigarrillos por año). Los fumadores actuales y ex-fumadores recientes (menos de 1 año) al momento del estudio fueron considerados como fumadores. Cada uno de los participantes debió firmar un consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el Comité de Etica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.

Análisis genotípico. Para examinar los polimorfismos de interés, se aisló ADN genómico total de sangre periférica y se utilizó amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y posterior digestión con enzimas de restricción.

CYP1A1: Para la detección del polimorfismo Msp1, la amplificación por PCR fue llevada a cabo utilizando los partidores C44 y C47³⁷, que amplifican un fragmento de 340 pb (pares de base).

GSTM1: La deleción del gen GSTM1 fue determinada usando los partidores descritos por Ambrosone et al (1995), en forma simultánea con los partidores Msp1, de modo de usarlos como control interno de amplificación³⁸. La presencia del genotipo nulo de GSTM1 fue determinada por la ausencia de un fragmento de 273 pb, postamplificación, observada en un gel de agarosa 2% con bromuro de etidio y análisis bajo luz ultravioleta.

Digestión con enzima de restricción Msp1. Los productos de PCR fueron sometidos a digestión por la enzima de restricción Msp1 a 37°C por 4 h (GIBCO BRL, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). El resultado de esta digestión fue analizado bajo luz ultravioleta en geles de agarosa 2% o acrilamida 6% (Biorad Lab., Richmond, CA), según requerimiento de resolución de bandas. La presencia del alelo infrecuente m2 se pudo apreciar por la aparición de dos bandas de 200 y 140 pb, productos de la digestión de la banda de 340 pb que denota el alelo silvestre.

Nomenclatura de polimorfismos. Para CYP1A1 el alelo silvestre se denomina m1 y el alelo raro m2. Para GSTM1 el genotipo nulo (GSTM1 (-)) corresponde a la deleción homocigota del gen que genera ausencia de expresión y por tanto, de actividad catalítica; el genotipo presente (GSTM1 (+)) corresponde a la variante más frecuente, conocida como silvestre y que posee el gen activo (homocigoto o heterocigoto).

Estadística. Las frecuencias genotípicas para GSTM1 y CYP1A1 fueron calculadas como la proporción de individuos con un genotipo dado, dividido por el número total de participantes y se realizaron pruebas para analizar las potenciales desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg, comparando los genotipos observados con los esperados, usando el test de χ². Los test de χ² se utilizaron también para comparar la prevalencia de los diferentes genotipos para GST y CYP1A1 entre pacientes y controles. La interacción entre los genes, los factores ambientales y su asociación con cáncer gástrico, fue evaluada utilizando tablas de contingencia de 2 por 4³⁹. Las interacciones fueron estimadas usando como referencia una combinación genotípica-ambiental de bajo riesgo (variantes CYP1A1 m1m1 o GSTM1 presente en individuos no fumadores y no bebedores, respectivamente). El riesgo conjunto estimado entre los portadores de los genotipos susceptibles en fumadores y bebedores, comparado con los no portadores que ni fuman ni beben y el CaG fue evaluado por Odds Ratios (ORs), ajustados por edad y sexo, usando un modelo de regresión logística no condicional. La precisión fue estimada calculando intervalos de confianza de 95%. Todos los análisis estadísticos fueron realizados usando el software STATA 7.0⁴⁰.

Resultados

La Figura 1 muestra los resultados de genotipificación simultánea de CYP1A1 y GSTM1 para 6 muestras de ADN de pacientes con cáncer gástrico en un gel de agarosa a 2%. En esta figura se observan diferentes alternativas genotípicas para ambas enzimas. La ausencia de una banda de 273 pb denota el genotipo nulo de GSTM1 (pacientes D, E y F). La digestión de la banda de amplificación de 340 pb, correspondiente a un fragmento del gen CYP1A1 y aparición de bandas de 200 y 140 pb. (pares de bases) denota la presencia de la variante m2, en forma heterocigota (pacientes B y E) u homocigota (paciente F).

Figura 1. Análisis genotípico para CYP1A1 y GSTM1 de 6 pacientes con cáncer gástrico (A a F). A: Genotipo m1m1 y GSTM1(+), B: Genotipo m1m2 y GSTM1(+), C: Genotipo m2m2 y GSTM1(+), D: Genotipo m1m1 y GSTM1(-), E: Genotipo m1m2 y GSTM1(-), F: Genotipo m2m2 y GSTM1(-), G: Estándar de ADN.

La Tabla 1 muestra los resultados generales para los análisis estadísticos de riesgo, ajustados por la edad y sexo de los individuos. En ella se puede apreciar que para el gen CYP1A1, ninguno de los genotipos por sí solo representa un riesgo estadísticamente significativo. Del mismo modo, la ausencia del gen GSTM1 no conduce a un riesgo aumentado de cáncer gástrico. El consumo de alcohol, por su parte, presenta mayor frecuencia en los casos (43,8%) respecto de los controles (28,5%), lo que representa un riesgo aumentado de la patología (OR: 3,36; IC 95% 1,76-6,41) estadísticamente significativo. Del mismo modo, el hábito tabáquico por sí solo genera un riesgo significativamente mayor de presentar la patología (OR: 2,54; IC 95% 1,45-4,46).

En la Tabla 2, se presenta la evaluación de las interacciones entre genotipos y los factores ambientales estudiados en pacientes con CaG. Como puede observarse, los efectos conjuntos para individuos portadores de genotipos susceptibles de CYP1A1 (m1m2 y m2m2) presentaron valores de OR elevados (OR: 2,77; IC 95% 1,06-7,25 y 13,65; IC 9% 3,15-59,05) cuando fueron evaluados en conjunto con el hábito alcohólico, con respecto a aquellos individuos portadores de estas variantes, pero que no consumen alcohol (OR: 1,39; IC 95% 0,68-3,39 y 0,62; IC 95% 0,14-2,20) o respecto de la población general (OR: 1,11; IC 95% 0,61-1,99 y 1,23; IC 95% 0,49-3,04, Tabla 1). Por otro lado, la presencia del genotipo nulo de GSTM1 parece no modificar el riesgo de cáncer gástrico, dado que el valor observado en individuos bebedores con genotipo nulo (OR: 3,36) es idéntico al observado para el alcohol por sí solo (OR: 3,36, Tabla 1).

En la Tabla 3 se puede apreciar que, en individuos fumadores, la presencia de los genotipos m2m2 y m1m2 representa un riesgo aumentado dado que por una parte, los valores de riesgo obtenidos (OR: 8,37; IC 95% 1,86-37,64 y 2,41; IC 95% 1,04-5,56) son superiores a aquellos obtenidos en individuos no fumadores (OR: 0,81; IC 95% 0,21-3,17 y 1,16; IC 95% 0,48-2,79) y por otro lado, el valor de riesgo obtenido para la confluencia m2m2/tabaco es muy superior al del hábito tabáquico por sí solo, en la población total (OR: 2,54, Tabla 1). Por otra parte, la presencia del genotipo nulo de GSTM1 parece no modificar el riesgo, dado que el valor de OR observado (2,40) es similar al del tabaco por sí solo, más aún, la presencia del genotipo nulo parece ser protector, dado que se observa un OR mucho menor a la unidad (0,30).

Discusión

Muchos artículos se han escrito acerca de las interacciones genéticas y genético-ambientales, de su relación con la susceptibilidad a diferentes tipos de cáncer^41-45, y, en especial, sobre polimorfismos en genes de baja-penetrancia que codifican para determinadas vías metabólicas en el organismo¹¹.

En este estudio, se analizaron en 73 pacientes y 263 controles, las variantes alélicas de CYP1A1, enzima que bioactiva hidrocarburos aromáticos como el benzo(a)pireno transformándolos en epóxidos y productos fenólicos mutagénicos y carcinogénicos; por consiguiente, una alta actividad enzimática puede predisponer a los pacientes al riesgo de cáncer por aumento de los compuestos carcinogénicos a nivel de los tejidos⁴⁶. Por otro lado, se estudió la deleción de GSTM1, una enzima perteneciente a la familia de las glutatión S-transferasas, las cuales catalizan la unión de glutatión con numerosos compuestos potencialmente genotóxicos, tales como radicales aromáticos y epóxidos.

Los resultados obtenidos muestran que los genotipos de CYP1A1 denominados de riesgo (m1m2 y m2m2), por sí solos no se encuentran asociados a cáncer gástrico, sin embargo, en individuos fumadores o bebedores, la asociación es muy clara, con valores de riesgo muy superiores a los obtenidos para cada uno de los factores individuales. Esto se debería a que para la manifestación del riesgo es necesario considerar el factor ambiental, dado que, si bien es cierto se ha sugerido que el alelo m2 de CYP1A1 sería responsable de una mayor actividad de la enzima⁴⁴, se requiere la presencia del sustrato para su manifestación clínica, es decir, la presencia de hidrocarburos aromáticos policíclicos, los que son componentes importantes del humo del cigarrillo y, en general, de los procesos de combustión incompleta de materia orgánica¹⁹.

A pesar de que el alcohol no es sustrato de la enzima CYP1A1, se observó una asociación significativa, esto podría deberse a que, en general, los individuos fumadores son los mismos bebedores, por lo que existe una autocorrelación que no permite una disociación entre estos dos factores. Por otro lado, ha sido demostrado que el alcohol potencia la formación de aductos de benzo(a)pi-reno⁴⁷, lo que en parte podría explicar la asociación observada.

Por otro lado, el genotipo nulo de GSTM1 no parece conferir un riesgo de presentar esta patología, dado que tanto solo como en combinación con el hábito tabáquico o alcohólico, los valores de riesgo obtenidos son menores a 1,0, aún más, para el genotipo nulo de la enzima en ausencia del tabaco o el alcohol los valores son aún más bajos, alcanzando para el genotipo el valor de OR: 0,30, lo que indica un potencial efecto protector de esta variante. Por otra parte, diferentes estudios en japoneses y chinos han informado que el genotipo nulo M1 de GST ha sido asociado con cáncer gástrico^34,35,48. Shen y cols (2005), en un estudio realizado en individuos chinos, informaron similares hallazgos a los reportados en nuestro estudio. Ellos encontraron un riesgo aumentado de cáncer gástrico en aquellos individuos fumadores y portadores de las variantes genotípicas polimórficas²⁸.

Estas inconsistencias en los hallazgos reportados podrían estar explicados por la diversidad étnica, diferentes tipos histológicos involucrados, y otro tipo de covariables ambientales, tales como la dieta y exposición a otros contaminantes ambientales, ocupacionales e infecciones asociadas a H pylori. También debe considerarse que la magnitud y dirección de las modificaciones observadas debieran ser definidas y complementadas en un estudio de mayor número de casos, ya que una de las principales restricciones, al momento de hacer estos estudios donde se evalúan interacciones, es el tamaño de la muestra^49,50, esto permitiría, además, la incorporación de otros factores genéticos relevantes no evaluados en este estudio, como lo son variantes genéticas de enzimas metabolizadoras del alcohol, antioncogenes, enzimas de reparación del ADN.

En conclusión, nuestros resultados sugieren que en las interacciones genotípico-ambientales estudiadas, la presencia de las variantes genéticas de CYP1A1 tendrían un efecto modificador del riesgo de cáncer gástrico inducido por el hábito de fumar y el consumo de alcohol. Esta asociación es importante, si consideramos que en la población chilena el hábito de fumar y beber alcohol es muy prevalente. Según en sexto estudio de la Comisión Nacional de Control de Estupefacientes (CONACE), la prevalencia del consumo de alcohol en el periodo 1994 a 2004 ha aumentado desde 40% a 58% y el hábito de fumar se ha mantenido en 40%⁵¹.

 

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Agradecimientos

Los autores desean agradecer por una parte, la colaboración del Dr. Jorge Soto Labbé, por su revisión crítica del manuscrito y, por otra parte, a los pacientes y controles incorporados en este estudio, que de manera muy altruista contribuyeron con sus muestras y sus antecedentes, como una forma de aportar a la investigación en esta área.

Correspondencia a:Luis Quiñones Sepúlveda. Laboratorio de Carcinogénesis Química y Farmacogenética, Programa de Farmacología Molecular y Clínica, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Casilla 70000, Santiago 7, Chile. Teléfono: 562 9786376. E mail: lquinone@med.uchile.cl

Recibido el 21 septiembre, 2005. Aceptado el 24 marzo, 2006.

Financiamiento: Proyecto FAI-MED-001-06