Rev Méd Chile 2007; 135: 167-173

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

Detección y tipificación de virus papiloma humano en lesiones preneoplásicas del cuello uterino mediante PCR-RFLP

Detection and typification of human papilloma virus in pre cancerous cervical lesions

Susana Aedo A¹, Angélica Melo A¹, Patricia García¹, Pablo Guzmán G¹, Italo Capurro V², Juan Carlos Roa S¹.

¹Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Temuco, Chile. ²Departamento de Obstetricia y Ginecología, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Temuco, Chile.

Dirección para correspondencia

Background: The association of different genotypes of human papilloma virus (HPV) with cervical cancer is well known. However, there is little information about their association with pre-cancerous lesions. Aim: To assess the frequency of different HPV genotypes in pre cancerous cervical lesions. Material and methods: A cervical sample was obtained by cytobrush in 15 women with low grade lesions and 40 women with high grade lesions, subjected to conization by loop electrical excision procedure (LEEP). Detection and typification of HPV was done by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism. Results: All women were infected with HPV. Eighty five percent of samples were typified. A unique HPV subtype was found in 76% of women. Fourteen percent had an infection with multiple subtypes and in 10%, the viral genotype was not identified. The most common subtypes found were HPV 16, HPV 52 and HPV 53. Conclusions: There is a high rate of infection with HPV with a high oncogenic risk among these women.

(Key words: Human papilloma virus; Oncogenes; Uterine cervical cancer)

En Chile, el cáncer de cuello uterino (CCU) ocupa el tercer lugar entre los cánceres de la mujer, después del cáncer de vesícula biliar y el cáncer gástrico. En la IX región, el CCU corresponde a 11,7% del total de tumores malignos, ocupando el segundo lugar en las mujeres con 20,3%¹.

La infección genital por virus papiloma humano (HPV) es una enfermedad de transmisión sexual^2,3 con una reconocida asociación con lesiones preneoplásicas y neoplásicas del cuello uterino^4-6. En nuestro país, existen escasos estudios publicados sobre detección de HPV y su relación con neoplasia cervical intraepitelial (NCI) y CCU^7,8. Los genotipos de HPV que infectan el tracto genital femenino, se han clasificado en 2 grupos: de bajo riesgo (BR) y de alto riesgo (AR) según el potencial oncogénico para el desarrollo de lesiones preneoplásicas o neoplásicas. Los genotipos de bajo riesgo (BR) más frecuentes son los HPV: 6, 11, 43 y 44 y se asocian con condilomas o neoplasias cervicales intraepiteliales de bajo grado (LBG). En el grupo de alto riesgo (AR) 15 tipos de HPV han sido identificados (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82), detectados principalmente en neoplasia cervical intraepitelial de alto grado (LAG) y carcinomas^9-11.

Uno de los métodos más usados para la detección de HPV en muestras de citología cervicouterina es la captura híbrida, que cuenta con la aprobación de la Food and Drug Administration (FDA) para uso clínico^12,13 y se utiliza como método de screening¹⁴. Sin embargo, esta técnica discrimina solamente entre tipos de AR y BR, sin informar sobre el genotipo viral específico. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es, actualmente, el método más sensible para la detección de HPV. Se han desarrollado diferentes protocolos de PCR para detectar un amplio espectro de genotipos de HPV, usando partidores genéricos que reconocen secuencias específicas del genoma viral^15-18. Para tipificar los tipos virales a partir de los productos de la amplificación, se han utilizado distintos métodos: Southern blot, hibridación Dot Blot, enzimas de restricción (RFLP), secuenciación y enzimoinmunoensayo^19,20.

En nuestro país, dos estudios realizados en muestras citológicas en mujeres aparentemente sanas, utilizando el método de «captura híbrida», y enzimoinmunoensayo detectaron ADN HPV en 8% y 14% de las pacientes. En estos estudios 83,8% y 71% de los casos, respectivamente, correspondió a HPV AR^21,22, sin embargo, no existe mayor información en portadoras de lesiones preneoplásicas.

El objetivo de este estudio fue determinar la frecuencia de los distintos genotipos de HPV cervical en muestras de cepillado cervical en un grupo de mujeres con diagnóstico de LBG y LAG cervical uterina, mediante técnica combinada de PCR-RFLP.

MATERIAL Y MÉTODO

Muestra. Se analizaron muestras de cepillado cervical de un total de 55 mujeres del policlínico de Patología Cervical del Hospital Hernán Henríquez Aravena de Temuco, con diagnóstico histopatológico de: LBG (displasia leve y signos morfológicos de infección por virus papiloma) y LAG (displasia moderada, displasia intensa, carcinomas in situ). La muestra se recolectó momentos antes de la realización de una conización mediante asa LEEP (loop electrical excision procedure). El estudio fue autorizado por el Comité de Ética del Servicio de Salud de la Región de la Araucanía y las pacientes fueron ingresadas previa firma de consentimiento informado.

El material cervical se recolectó en 3 ml de Buffer TE pH 7.4 (10 mM Tris.Cl, 1 mM EDTA pH 8). El ADN fue extraído con el kit Puregene^TM DNA Isolation System (Gentra System, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN se almacenó a -20°C hasta su análisis. Se certificó la calidad del ADN extraído, mediante la amplificación fragmento de 268 pares de bases (pb) dentro del gen ß-globina, usado como un control interno, con los iniciadores PCO4 5' CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3' y GH20 5' GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3'²³.

Detección de HPV. La detección de HPV se realizó mediante PCR anidada (PCR L1), usando el par de iniciadores de consenso externos MY09/MY11⁴ y el par de iniciadores internos GP5+/GP6+⁴, dirigidos a la región L1 del HPV y que amplifican un fragmento de 450 y 150 pb, respectivamente. Se utilizaron como controles positivos plásmidos recombinantes para los tipos de HPV: 6, 16 y 18. Como control blanco se reemplazó el ADN por agua desionizada. El análisis de los productos de amplificación se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Tipificación de subtipos virales mediante PCR-RFLP. Se utilizó primers My09/My11 que amplifican fragmento de 450 bp. El producto PCR fue sometido a RFLP con las enzimas Rsa I y Dde I, cuyas secuencias específicas de corte son GT/AC y C/TNAG, respectivamente. Donde «N» indica que en esa posición puede situarse cualquiera de las 4 bases. Se incubaron durante 14 h a 37°C. Los fragmentos digeridos fueron sometidos a electroforesis en geles de poliacrilamida al 10%.

Para interpretar el polimorfismo de los fragmentos digeridos, se confeccionó un patrón de restricción para cada enzima. Las secuencias completas de los tipos más frecuentes de HPV (AR y BR) se obtuvieron del GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy). Se ubicó la región L1, y dentro de ésta, la posición de los iniciadores y los puntos de corte de cada enzima.

En la Figura 1 se presenta el patrón de restricción con la enzima Rsa I. En los carriles 1 y 5 corresponde al tipo HPV 18, en el carril 4 al HPV 35. En los carriles 2 y 3, los fragmentos de restricción son del mismo tamaño para los tipos HPV 16 y 56; esto se resuelve utilizando una segunda enzima (DdE I), que divide nuevamente los fragmentos amplificados en tamaños únicos y específicos para los genotipos HPV16 56.

RESULTADOS

Del total de los 55 casos estudiados, 15 correspondieron a lesiones de bajo grado, 40 a lesiones de alto grado; la edad de los pacientes fluctuó entre 18 y 77 años, con un promedio de 38,5 años. Detección de HPV: Dos fueron ß-globina negativas y, por tanto excluidas del estudio. De las 53 muestras restantes, todas resultaron HPV positivas con la PCR L1 anidada (fragmento de 150pb). Sin embargo, cuando se realizó la PCR simple L1 outer, se obtuvo suficiente producto de PCR (450 pb) requerido para las digestiones enzimáticas (RFLP) en 48 de los 53 casos (90,6%).

Tipificación de HPV. Los resultados de la tipificación viral se observan en la Tabla 1. Se detectaron 13 genotipos diferentes de HPV, el más frecuente fue el HPV 16, con 30,8%, seguido por el HPV 52, con 13,5%, el HPV 18 y 53, con 11,5%, el HPV 59, con 9,6% y HPV 31, con 3,8%. Los genotipos menos frecuentes fueron el HPV 11, 35, 42, 56 y 58, con un 1,9%. Se destaca en esta Tabla que el genotipo HPV 16 fue el más frecuente en las LAG (34,1%) y el subtipo HPV 52 (37,5%) en las LBG. En 15% (7/48) de los casos se logró identificar casos que presentaban infección múltiple (IM) (Tabla 2).

DISCUSIÓN

Las frecuencias observadas para el HPV 16 y 18 son similares a lo reportado en estudios previos realizados en la región^7,8 y el alto número de HPV de AR es comparable a la prevalencia de casos de CCU que presenta nuestra región¹. Los virus de AR HPV 16, 18, 52, 53, fueron los más frecuentemente encontrados, tanto en las LBG como en las LAG. En el presente estudio, el HPV 16 fue el genotipo más frecuente, coincidiendo con lo descrito en México²⁴ y otros países latinoamerica

nos^25-28. Otros subtipos virales como HPV 18, HPV 45, HPV 31 y HPV 33 han sido encontrados los más frecuentes en diversas series^7,29-31. En nuestro estudio, se observó como el genotipo de mayor frecuencia es HPV 52 en las LBG (37,5%) y el HPV 16 (34,5%) en las LAG seguido por el HPV 18. No obstante, es un hecho conocido la existencia de diferencias geográficas en cuanto a la frecuencia de los HPVs. Liaw y cols, fueron los primeros en reportar que los HPV 52 y 58 eran los subtipos más prevalentes en LAG y carcinoma en China³². En Asia, los HPV 58 y 52 son más comunes que HPV 43, 31 y 33³¹ Bayo y cols, en Mali, Africa, describió a HPV 51 y 73 en biopsias frescas de carcinoma como nuevos genotipos frecuentes de HPV, aparte del HPV 16 y 18³¹. Sasagawa y cols, observaron los genotipos de HPV 11, 39, 42, 44, 53, 54 y 59 exclusivamente en LBG y no encontraron los tipos 39, 53 y 59 que son considerados de AR en LAG y carcinoma invasor³³.

La técnica de PCR-RFLP tiene la característica de poder determinar más de 30 genotipos virales anogenitales con una única reacción de amplificación, siendo su mayor ventaja frente a las metodologías que emplean iniciadores específicos, pero su mayor desventaja es justamente no poder definir en ciertos casos los genotipos asociados cuando se presentan infecciones múltiples, que frecuentemente producen patrones de restricción confusos. Frente a estos resultados, se puede optar por otras metodologías moleculares de identificación como son la PCR con posterior hibridación por Dot Blot, PCR con iniciadores específicos, o la secuenciación, permitiendo verificar variantes dentro de un subtipo o nuevos genotipos de HPV^34-36. En nuestro estudio, 5 (10%) muestras presentaron patrones de restricción que no coincidieron con los tipos de HPV incluidos en la Tabla 1. Este hecho es esperable, ya que sólo se trabajó con 2 enzimas.

En 15% (7/48) de los casos se logró, con las 2 enzimas de restricción empleadas, identificar casos que presentaban IM y los subtipos involucrados. El HPV 18 fue el más frecuente, seguido por el HPV 59. En dos casos fueron identificables 3 genotipos virales. Los genotipos HPV 11 y HPV 42 (considerados de BR) y el HPV 31 solamente se observaron en casos con IM (Tabla 2).

La IM ha sido mencionada como un factor común en mujeres jóvenes y se explica por resistencia inmunológica, permitiendo que una infección por HPV persista³⁷, provocando además, mayor susceptibilidad a una reinfección^37,38. Por otro lado, se ha reportado que en los casos con IM, no ha habido un aumento significativo en el riesgo de desarrollar una NCI al compararlos con mujeres infectadas con un solo genotipo viral³⁹.

Cinco muestras de HPV positivas no pudieron someterse a restricción enzimática debido a la escasa cantidad de material amplificado, insuficiente para generar un patrón de bandas analizable. Suponemos que estos casos pueden corresponder a aquellos en los que la carga viral en la muestra obtenida se encuentra en el límite de la sensibilidad de la técnica. Estudios publicados han concluido que el uso de una PCR anidada, usando los iniciadores MY09/MY11 y GP5+/GP6+, puede aumentar considerablemente su sensibilidad de 10 a 100 veces, en comparación con una PCR simple que emplea únicamente los iniciadores MY09/MY11^40-42. Un estudio multicéntrico realizado en España y Colombia, utilizó los iniciadores MY09/MY11 e identificó ADN viral en 75% de los casos; el resto de las muestras las reanalizaron usando el sistema GP5+/GP6+ y obtuvieron un incremento de 20% en el rango de detección del ADN viral³⁹.

Finalmente, podemos decir que la utilización de la técnica de PCR-RFLP para la detección de HPV en muestras de cepillado cervical fue exitoso y que permitió identificar en nuestros pacientes los genotipos virales considerados epidemiológicamente más importantes. Por otro lado, los resultados del presente estudio demuestran que, además del HPV 16 que es el de mayor prevalencia a nivel mundial, se debe prestar atención a otros genotipos, que aunque de menor frecuencia pudieran tener importancia epidemiológica local.

La alta frecuencia de HPV de alto riesgo oncogénico, en lesiones de alto y bajo grado surge como buena explicación para las altas incidencias de cáncer cervicouterino en nuestra región. Conocer la frecuencia y distribución de los subtipos virales de HPV puede contribuir a medir la efectividad de una eventual vacuna en nuestra población y ayudar a racionalizar los recursos de nuestro programa nacional de detección de cáncer cuello uterino.

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Recibido el 7 de marzo, 2006. Aceptado el 16 de agosto, 2006.

Financiado en parte por la Dirección de investigación de la Universidad de La Frontera. Parcialmente financiado por proyecto DIUFRO 120534.

Tesis de licenciatura de TM Susana Aedo.

Correspondencia a: Dr. Juan Carlos Roa. Departamento de Patología, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Manuel Montt 112. Temuco, Chile. Código Postal 478-1176. E mail: jcroa@ufro.cl