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Revista médica de Chile

Print version ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile vol.143 no.10 Santiago Oct. 2015

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872015001000011 

ARTÍCULO DE REVISIÓN

 

Neurofibromatosis tipo 1 (NF1) y su diagnóstico molecular como estrategia del diagnóstico diferencial y a edades tempranas

Molecular diagnosis as a strategy for differential diagnosis and at early ages of neurofibromatosis type 1 (NF1)

 

Martha Gómez1,a, Oriana Batista1,2,b

1 Centro Especializado de Genética (CEGEN), Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, Universidad Autónoma de Chiriquí (UNACHI), ciudad de David, provincia de Chiriquí, República de Panamá.
2 Centro Gendiagnostik, S.A., ciudad de David, provincia de Chiriquí, República de Panamá.
a Licenciada en Biología.
b Geneticista clínica molecular, M.Sc., Dr.rer.nat.

Correspondencia a:


Neurofibromatosis type 1 (NF1), is a haploinsufficient and multisystemic disease, caused by inherited or sporadic mutations in the NF1 gene. Its incidence is one in 2,500 to 3,000 individuals, it has an autosomal dominant pattern of inheritance, high clinical variability, complete penetrance and age-dependent complications. Neurofibromin is the product of the NF1 gene and is believed to act as a tumor suppressor since the loss of its function has been associated with benign and malignant tumors in neural crest-derived tissues. Only two correlations between clinical phenotype and mutant alleles in the NF1 gene have been observed. The established criteria for disease diagnosis are very efficient in adults and children older than 3 years of age, but not for children under this age. Mutational analysis is therefore recommended to confirm the disease in young children with a negative family history. A pathogenic mutation in the NF1 should be added to the list of diagnostic criteria. Mutational analysis is also recommended for differential diagnosis and for prenatal or pre-implantation genetic diagnosis, taking into consideration the family history and the type of method to be applied. Molecular studies of this disease using different complimentary molecular techniques and bioinformatics tools have characterized NF1 gene mutations at both the DNA and mRNA levels, increasing the mutational spectrum. Consequently, about 1,289 defects have been reported to date, mainly nonsense/missense mutations, deletions and splice site defects.

Key words: Child; Computational Biology; DNA Mutational Analysis; Neurofibromatosis 1; Neurofibromin 1.


 

La Neurofibromatosis tipo 1 (NF1; MIM #162200), es un desorden con patrón de herencia autosómico dominante e incidencia de 1 en 2.500 a 3.000 individuos1. Es una enfermedad multisistémica ocasionada por mutaciones heterogéneas en el gen NF1, las cuales son esporádicas en, aproximadamente, 50% de los casos2. NF1 fue identificado y su proteína caracterizada, por Cawthon y cols. y Wallace y cols., respectivamente, en 1990. La secuencia del ADNc fue descrita por Gutmann y Collins y Viskochil y cols., en 19933.

A pesar de que, aproximadamente, 1289 mutaciones han sido reportadas (HGMD-Human Gene Mutation Database), pocas son las relaciones genotipo-fenotipo, descritas.

NF1 se caracteriza por extrema variabilidad clínica entre individuos afectados no relacionados, entre miembros afectados de una familia, y en una persona en diferentes etapas de su vida. Adicionalmente, la frecuencia de complicaciones se incrementa con la edad3.

El diagnóstico clínico de los pacientes con NF1, se basa en los criterios establecidos en la conferencia para el desarrollo de consensos del Instituto Nacional de Salud (siglas en inglés NIH), en 19884, los cuales toman en consideración la condición de afectación de piel, huesos y sistema nervioso, principalmente. Aunque estos criterios resultan ser altamente específicos y sensitivos en adultos5, no se presentan en algunos niños menores de 8 años6. Para este último grupo, el diagnóstico molecular sería útil, pues aproximadamente, la mitad de aquellos que están afectados y no presentan antecedentes familiares, reúnen los criterios para el diagnóstico al año de edad, y la mayoría de ellos, cumplirán con éstos a los 8 años.

Aunque en algunos laboratorios el diagnóstico genético de NF1 es rutinario, algunos factores tales como su gran tamaño, la carencia de sitios específicos de mutación y la presencia de pseudogenes, hacen laboriosa la identificación de mutaciones en NF1. A continuación, se presenta una revisión de algunos aspectos moleculares de la NF1, sus características genéticas, manifestaciones, criterios para el diagnóstico clínico, y algunos estudios mutacionales del gen. Adicionalmente, se muestra la utilidad del análisis mutacional como aporte al diagnóstico en niños menores, al diagnóstico diferencial de la enfermedad y al pre-natal y/o preimplantacional.

El gen NF1 codifica la proteína neurofibromina, asociada con la supresión tumoral

El gen NF1 se localiza en el cromosoma 17q11.27-9, tiene un tamaño genómico de 282,751 pb, 60 exones, y codifica al menos tres transcritos solapados10. Cuatro exones alternativamente empalmados11 y pseudogenes en los cromosomas 2, 14, 15, 18, 21 y 223 han sido descritos. Adicionalmente, en el intrón 27 se localizan los genes EVI2A, EVI2B (ecotropic viral integration site 2A y 2B) y OMGP (oligodendrocyte-myelin glycoprotein) que se transcriben en dirección opuesta al NF112-14.

La transcripción de NF1 ocurre en dirección centrómero-telómero, y genera un ARNm de 11 a 13 kb, con un marco de lectura abierto de, aproximadamente, 9 kb. Su producto proteico, neurofibromina, tiene 280 kDa y expresión ubicua11 en fibroblastos de piel, cerebro, bazo, pulmón, músculo, neuroblastoma, neurofibroma, células de neurofibrosarcoma NF1, carcinoma de colon y cáncer de mama, entre otros8,15,16.

La función de los 3 dominios que forman la proteína17-19 se comprende parcialmente. El dominio GRD (GAP-related domain) de, aproximadamente, 360 aminoácidos, ubicado en la región central de la neurofibromina y determinado por los exones 20 a 27a, muestra homología estructural y funcional con la familia de proteínas activadoras de GTPasa (GAP). Este dominio interactúa con la proteína ras-GTP y promueve la conversión de ras-GTP a su forma inactiva ras-GDP regulando negativamente la vía de señalización p21ras17,20,21. Consecuentemente, a la neurofibromina se le considera un supresor tumoral22, pues la reducción de su producción (en células haploinsuficientes) o la completa pérdida de ésta, conlleva la activación de la proteína ras, que a su vez regula una cascada de vías de señalización posteriores, entre ellas, las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), fosfoinositol 3-quinasas (P13K), proteína quinasa B (PKB) y proteína quinasa diana de rapamicina en células de mamífero (mTOR)3. La activación de estas vías, ocasiona una variedad de efectos celulares que, generalmente, estimulan la supervivencia y proliferación celular23 (Figura 1).

 

Figura 1. La neurofibromina actúa como regulador negativo de la vía de señalización Ras,
promoviendo su forma inactiva Ras-GDP. La neurofibromina es un tipo de proteína activadora
de la actividad GTPasa (GAP) que se une a la forma activa de la proteína ras (ras-GTP) y la
inactiva (ras-GDP) y, consecuentemente, no hay proliferación ni supervivencia celular alterada.
Los factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) realizan el paso contrario, reactivando
a Ras al promover el intercambio de GDP a GTP. La pérdida de la función de la neurofibromina, en
individuos NF1 heterocigotos y homocigotos evita la conversión de Ras-GTP a Ras-GDP, y esto a
su vez, desencadena cascadas de señalización posteriores con efectos de supervivencia y
proliferación celular, entre otros (ver texto para información detallada). Abreviaturas: Ras-GDP,
forma inactiva de la proteína Ras unida a guanosín difosfato. Ras-GTP: forma activa de la proteína
Ras unida a guanosín trifosfato. Raf: serina-treonina proteína cinasa. MAPK: proteínas cinasas
activadas por mitógenos. P13K: fosfoinositol 3-cinasas. Akt/PKB: proteína cinasa B. mTOR:
proteína cinasa diana de rapamicina en células de mamífero.

La pérdida de la función de esta proteína, se asocia con tumores benignos y malignos encontrados en tejidos derivados de la cresta neural24. Así, generalmente, en ausencia o reducción drástica de la neurofibromina, se pueden encontrar niveles elevados de ras-GTP en tumores de los nervios periféricos de pacientes con NF125. El aumento del riesgo de tumores malignos en NF1, es compatible con la pérdida de función de la neurofibromina, como regulador negativo del oncogén ras21.

Los otros dominios potenciales funcionales en la neurofibromina son: un dominio rico en residuos de cisteína y serina (CSRD) entre el exón 11 y 17 que codifica varios sitios de reconocimiento para proteína quinasa dependiente de AMP cíclico18, y el dominio NF1-Sec-PH relacionado con la unión a fosfolípidos19. Interacciones directas o indirectas entre la neurofibromina y otras proteínas, también han sido documentadas, aunque no se conoce su significado biológico26.

La NF1 se hereda de forma autosómica dominante, su fenotipo es variable y completamente penetrante

La pérdida de función de un gen es causada por mutaciones que interrumpen su capacidad codificante27. NF1 exhibe un patrón de herencia autosómico dominante, los individuos afectados tienen un genotipo heterocigoto y la descendencia de éstos tiene 50% de riesgo de heredar el gen alterado28. La mutación en los individuos heterocigotos causa haploinsuficiencia, y por ello, la única copia funcional no produce suficiente neurofibromina para asegurar un desarrollo y crecimiento celular normal26. No existen individuos homocigotos26 y los ratones homocigotos (Nf1-/-) mueren en el útero, lo cual indica la importancia vital de la neurofibromina29,30. La penetrancia de NF1 es 100%26 y se completa, esencialmente, entre los cinco y ocho años de edad6,40.

NF1 tiene una de las tasas de mutación más altas y las mutaciones esporádicas ocurren casi en la mitad de los pacientes afectados31,32. Las mutaciones esporádicas en NF1 de la línea germinal, están sesgadas hacia el sexo. De éstas más de 80% tienen un origen paterno33. Otras mutaciones, llamadas microdeleciones del locus, tienen, en su mayoría, un origen materno34, abarcan, aproximadamente, 1,5 Mb e incluyen NF1 y regiones flanqueadoras35.

Gran variabilidad fenotípica entre pacientes con NF1, se aprecia intra e inter-familiarmente, aún cuando se presentan mutaciones idénticas en el gen36. Entre familias de Corea con la misma mutación, se observó que unos miembros manifestaron patologías malignas y otros menos severas. Intra-familiarmente, aunque madre e hija presentaron una deleción, del exón 2 al 47 (c.61-8315del), la primera, de 29 años, desarrolló sólo manifestaciones cutáneas, y la segunda, de 6,2 años, glioma cerebral, pseudoartrosis severa de tibia y escoliosis37.

Esta expresividad variable, podría deberse al efecto de genes modificadores o mutaciones somáticas secundarias dentro de los tejidos tumorales38,39. Adicionalmente, variantes de un gen podrían afectar la estructura y función de la proteína, y ocasionarían, así, fenotipos variables40.

Sólo dos correlaciones genotipo-fenotipo, las cuales, también, son ejemplos de la variabilidad fenotípica de NF1 han sido observadas: 1) la deleción completa del gen, microdeleciones NF1, caracterizada por la aparición temprana y numerosa de neurofibromas cutáneos, con mayor frecuencia y la severidad de anormalidades cognitivas, malformaciones, tumoración y riesgo aumentado de malignización41,42; y 2) la deleción específica de tres pb en el exón 17, c.2970-2972 delAAT (p.990delM), asociada con pigmentación, nódulos de Lisch y ausencia de neurofibromas cutáneos o neurofibromas plexiformes40.

Las manifestaciones clínicas como criterios para el diagnóstico

El diagnóstico de pacientes con NF1 se basa, primordialmente, en los criterios NIH4 (Tabla 1), pero también en otras manifestaciones, con frecuencia media y ocasional, abajo mencionadas5. Éste requiere de un examen clínico cuidadoso del paciente, sus padres, hermanos y una historia familiar detallada, que incluya información clínica y en ocasiones exámenes complementarios43.

 

Tabla 1. Criterios para el diagnóstico clínico
de la Neurofibromatosis tipo 1

Las manifestaciones clínicas más frecuentes en pacientes con NF1 son las alteraciones en las manifestaciones de la piel (más de 99%), neurofibromas cutáneos (más de 99%) [5 en superíndice], nódulos de Lisch (de 90-95%) y efélides (85%)5,40. Otras complicaciones en diversos sistemas podrían presentarse. Las discapacidades de aprendizaje, desarrollo de anormalidades esqueléticas, enfermedades vasculares, tumores del sistema nervioso central o malignos de la vaina de los nervios periféricos se presentan con frecuencia3. Algunas complicaciones raras, que afectan a menos de 5% de los pacientes incluyen epilepsia, hidrocefalia, problemas cardiovasculares y escoliosis distrófica44.

Los tumores del sistema nervioso central y los neurofibromas podrían resultar en importante morbilidad y mortalidad45 y reducir la esperanza media de vida de las personas con NF1 en, aproximadamente, 15 años. Las causas más importantes de muerte temprana son las manifestaciones malignas y enfermedades vasculares3,36,46. Individuos entre 20-35 años tienen 8-13% de riesgo de desarrollar tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos, predominantemente47, los cuales son difíciles de detectar, fácilmente metastásicos y a menudo de mal pronóstico48.

Fenotipos leves de NF1 son causados por mosaicismo originado por mutaciones después de la fertilización26 y se clasifican como segmentario, generalizado, o gonadal49. El generalizado es clínicamente similar a la NF1 clásica, pero se presenta poca o ninguna evidencia de la enfermedad al examinar los leucocitos sanguíneos para detectar mutaciones. El segmentario ocasiona regiones con alteraciones pigmentarias, crecimientos tumorales, o ambos, limitados a una o más regiones del cuerpo50. El gonadal, causa mutaciones en las gónadas, y puede deducirse cuando dos o más hijos de padres no afectados desarrollan la enfermedad51.

Utilidad del análisis mutacional para el diagnóstico de la NF1 en niños menores, en el diagnóstico diferencial y en el diagnóstico prenatal o preimplantacional

El análisis mutacional es, especialmente, útil en niños pequeños con historia familiar negativa y que llenan parcialmente los criterios de diagnóstico NIH, en niños con presentaciones atípicas3, en el diagnóstico diferencial o en el diagnóstico genético prenatal o preimplantacional5,50.

Aunque los criterios de diagnóstico NIH son útiles para la detección de NF1, algunos de éstos se manifiestan a una edad superior a los 3 años y están presentes al nacimiento sólo en algunos pacientes5. Por ello, el diagnóstico definitivo, usando dichos criterios puede ser realizado, para la mayoría entre los cuatro y cinco años28,40. Aproximadamente 46% de los casos esporádicos de NF1, no cumplen con dichos criterios a la edad de un año6.

Seis o más manchas café con leche se presentan desde el nacimiento, en más de 99% de los casos con NF1 y este criterio es el más frecuente5,6 y altamente sugestivo de la enfermedad52. Sin embargo, aproximadamente, 1% de los niños que manifestarán la enfermedad a edades superiores, podrían presentar un número inferior a seis manchas, lo cual no ayudaría en el diagnóstico clínico, pues menos de 1% de los niños menores de 5 años sin NF1, presentan más de dos manchas52. Otros infantes, cuyos padres no muestran signos de NF1, muestran manchas café con leche, sin otras manifestaciones3.

La prevalencia de la NF1 en Irlanda del Norte, en menores de 16 años53, fue 17,6 por cada 100.000 (1 en 5.681) niños y éstos desarrollaron numerosas complicaciones. Las más frecuentes, desde el nacimiento, incluyen dificultades de aprendizaje (30-60%), neurofibromas plexiformes (30-50%), escoliosis (10%)5 y glioma del nervio óptico (15-20%)5, 36. Estos últimos, se presentan antes de los seis años, pero podrían volverse sintomáticos en la infancia tardía o la adultez y causar ceguera28.

Un análisis mutacional exhaustivo permitiría identificar mutaciones en un poco más de 92% de pacientes que cumplen con los criterios NIH54,55. Este análisis, además, de permitir la confirmación del diagnóstico de NF1, facilitaría la identificación de las mutaciones en el afectado, útiles para diagnósticos pre-natales y pre-implantacionales de su futura descendencia debido a que sólo 50% de ésta tiene la probabilidad de tener la enfermedad. Mientras que el resultado del diagnóstico pre-natal podría sugerir a la pareja la interrupción terapéutica del embarazo, el diagnóstico pre-implantacional podría evitarlo56.

Los estudios mutacionales apoyarían, también, el diagnóstico diferencial de la NF1 respecto a síndromes como Noonan, LEOPARD, síndrome cardiofaciocutáneo, Costello, Legius, entre otros5,26. Estas condiciones comparten un grado variable de dificultad de aprendizaje, defectos cardiacos, dimorfismo facial, baja estatura, macrocefalia y anormalidades de la piel57. Por ejemplo, pacientes con fenotipo leve, quienes cumplen con los criterios para NF1, podrían padecer el síndrome Legius, caracterizado por mutación en SPRED158. Aproximadamente, 1 a 2% de pacientes que cumplen con los criterios de diagnóstico NF1, presentan mutaciones en SPRED159.

En resumen, todos los pacientes con mutación en NF1 manifestarán la enfermedad debido a que la penetrancia de NF1 es 100%26, pero no todos cumplirán con los criterios NIH antes de los cuatro o cinco años. Algunos pacientes que llenan estos criterios y exhiben fenotipos leves podrían presentar otros síndromes. Por estas razones, los estudios mutacionales pueden proveer información oportuna y una confirmación del diagnóstico clínico para un manejo personalizado del paciente. Adicionalmente, la información generada, mediante estos análisis, sería útil para los diagnósticos pre-natales, pre-implatacionales y las asesorías genéticas. Así, la idea de modificar6 e incluir la presencia de una mutación patogénica a los criterios NIH50,57 para facilitar el diagnóstico a edades muy tempranas es razonable. El aumento en la cantidad de estudios de diagnóstico molecular y en el número de mutaciones, también, demuestra la utilidad de los mismos para confirmar el diagnóstico clínico.

Panorama del análisis mutacional en NF1

La determinación de mutaciones en NF1 más que compleja es laboriosa, debido a numerosos exones codificantes, heterogeneidad mutacional, tamaño del gen y la ausencia de "puntos calientes"59-61. El reporte de mutaciones, ha aumentado desde 1992, cuando se creó el International NF1 Genetic Analysis Consortium con la finalidad de detectar las mutaciones y organizar la información creciente en bases de datos18. Así, en el consorcio se reportaron más de 100 mutaciones en la línea germinal en 199662 y 240 en 199763. HGMD (Human Gene Mutation Database), reportó más de 400 mutaciones en 200464 y más de 1.289, que incluyen mutaciones sin sentido, con sentido equivocado, errores de empalme; deleciones, inserciones e indels pequeñas; deleciones e inserciones gruesas; complejos y repeticiones en mayo de 2015.

Diversas técnicas moleculares utilizadas en estudios provenientes de países como Alemania18, Italia60,65,66, España22,61, Brasil64, Cuba67, Corea37 y Estados Unidos de Norteamérica69, ofrecen un amplio rango de sensibilidad para la detección de mutaciones en NF1. Las mismas, se pueden identificar en aproximadamente, 85-95% de los casos, utilizando una combinación de técnicas moleculares5. El porcentaje de sensibilidad mayor, 95%, se obtuvo al utilizar las técnicas combinadas MLPA, RT-PCR, DHPL y secuenciación22 (Tabla 2).

 

Tabla 2. Resumen de algunos estudios moleculares para determinar las
mutaciones en el gen NF1

Entre las métodos utilizados en los estudios anteriores figuran los de barrido tales como: SSCP, TGGE, DHPLC y PTT y otros a saber: secuenciación, qPCR, RT-PCR, MLPA y FISH (Tabla 2). Algunos laboratorios utilizan los métodos "de barrido", para minimizar los costos, pues aunque éstos no identifican el tipo de mutación, permiten descartar los exones normales, de los exones mutados en aquellos genes con heterogeneidad alélica fuerte, es decir, con posibilidad de mutaciones a lo largo de todo el gen. La detección exacta de la mutación debe realizarse, posteriormente, mediante secuenciación68, técnica que utiliza, frecuentemente, ADN genómico o ADN copia obtenido por RT-PCR, para detectar mutaciones puntuales que oscilan entre una base y algunas decenas de bases. Otros laboratorios con mayor facilidad económica o que conocen la mutación puntual existente en la familia utilizan la secuenciación como primera alternativa y esta práctica ha aumentado debido a la disminución de los costos asociados a la secuenciación en los últimos años. El MLPA, FISH, cariotipos, y métodos de análisis de múltiples polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) se utilizan para identificar mutaciones gruesas, es decir aquellas que involucran segmentos grandes incluso varios genes, y por lo tanto, permiten la detección de la deleción completa del gen, deleción de exones, duplicaciones y rearreglos cromosómicos.

El porcentaje de detección de mutaciones varía de acuerdo con los protocolos de análisis utilizados. Mientras que el protocolo de varios pasos, basado tanto en la secuencia del ADNc, ADN genómico, así como la deleción completa de NF1 identifica más de 95% de los casos, el de la secuencia genómica, únicamente, identifica, aproximadamente, 61%. El análisis de deleciones y duplicaciones, determina aproximadamente, 5% y el citogenético menos de 1%28.

Abundantes mutaciones (Tabla 2) fueron localizadas uniformemente en NF1, desde el exón 1 al 4718,37 y decayeron en densidad en los últimos exones22. El tipo de mutación más frecuente fue la sin sentido, producida por la introducción de un codón de parada prematuro, que a menudo altera el empalme del ARNm28 y origina formas truncadas de neurofibromina, observadas en 80%18, 77%61, 81%60, 76,9%37 y 72%22 de los casos.

Aunque las mutaciones sin sentido causan la terminación prematura de la proteína, las deleciones e inserciones pequeñas generan transcritos con corrimiento de lectura que, también, podrían producir proteínas truncadas. Igualmente, las mutaciones en sitios de empalme y deleciones gruesas en el gen, pueden generar proteínas acortadas37.

Mutaciones con sentido equivocado, las cuales producen sustitución de aminoácidos, en sitios conservados dentro de la proteína18,37,69, también, se reportaron y por la ubicación de su ocurrencia podrían resultar en un cambio funcional69. Deleciones completas del gen, se han encontrado, generalmente, entre 4-5% de los individuos con NF170. Otros estudios mostraron porcentajes similares 4,5%66, o aproximados 11%22, 1,59%69.

Herramientas y bases de datos bioinformáticas han sido utilizadas para caracterizar mutaciones en NF1: para el modelado molecular60,64, diseño de oligonucleótidos64,65 y determinación de mutaciones22,40,69. En la actualidad se utilizan herramientas computacionales para determinar los mecanismos de errores de empalme, la patogenicidad de las mutaciones y el alineamiento de proteínas69.

En resumen, la existencia de varios métodos moleculares así como el cúmulo de herramientas bioinformáticas aunadas a una estrategia metodológica bien planificada para la identificación de mutaciones en NF1, permitirá su identificación sin mayor dificultad. En este contexto, se sugiere considerar los siguientes aspectos: análisis de la región codificante y las regiones limítrofes exón - intrón, aplicación de métodos para detectar variables puntuales y gruesas, usar la secuencia de referencia genómica correcta, evaluar los antecedentes e historia familiar del paciente y el tipo de mutación a determinar y evitar la aplicación paralela de técnicas para ahorrar costos. Es preferible aplicarlas de manera paulatina hasta encontrar la mutación.

Agradecimientos: Extendemos un sincero agradecimiento al Centro Gendiagnostik, principal patrocinador de este artículo de revisión, así como la SENACYT, que a través de su plataforma ABC, desde la UNACHI, se permitió la descarga gratuita de numerosos artículos desde el portal ScienceDirect, haciendo la búsqueda bibliográfica más productiva.

 

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Recibido el 22 de noviembre de 2014, aceptado el 9 de julio de 2015.

Fuente de apoyo financiero: Este artículo fue financiado por el Centro Gendiagnostik, el Sistema Nacional de Investigación (SNI), la Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT/ APY-NI10-002 A) y la Vicerrectoría de Investigación y Posgrado de la UNACHI (VIP 184-CN-01-A092-022011).

Correspondencia a: Dra. Oriana Batista
Centro Gendiagnostik, Avenida Domingo Díaz y Calle Central. Ciudad de David, provincia de Chiriquí, República de Panamá. Apdo. postal: 0426-01262. Telefax: (507)-7742871
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