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06.03.2019 | Original Article

Local supplementation with plant-derived recombinant human FGF2 protein enhances bone formation in critical-sized calvarial defects

Zeitschrift:
Journal of Bone and Mineral Metabolism
Autoren:
Sher Bahadur Poudel, Chang-Ki Min, Jeong-Hoon Lee, Yun-Ji Shin, Tae-Ho Kwon, Young-Mi Jeon, Jeong-Chae Lee
Wichtige Hinweise

Electronic supplementary material

The online version of this article (https://​doi.​org/​10.​1007/​s00774-019-00993-2) contains supplementary material, which is available to authorized users.
Sher Bahadur Poudel and Chang-Ki Min contributed equally to this work.

Publisher's Note

Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.

Abstract

Numerous studies have demonstrated the advantages of plant cell suspension culture systems in producing bioactive recombinant human growth factors. This study investigated the biological activity of recombinant basic human fibroblast growth factor (rhFGF2) protein produced by a plant culture system to enhance new bone formation in a bone defect mouse model. The human FGF2 cDNA gene was cloned into a plant expression vector driven by the rice α-amylase 3D promoter. The vector was introduced into rice calli (Oryza sativa L. cv. Dongjin), and the clone with the highest expression of rhFGF2 was selected. Maximum accumulation of rhFGF2 protein (approximately 28 mg/l) was reached at 13 day post-incubation. Male C57BL/6 mice underwent calvarial defect surgery and the defects were loaded with absorbable collagen sponge (ACS) only (ACS group) or ACS impregnated with 5 μg of plant-derived rhFGF2 (p-FGF2) protein or E. coli-derived rhFGF2 (e-FGF2) protein. Similar to the effects of e-FGF2, local delivery with p-FGF2 enhanced bone healing in the damaged region to higher levels than the ACS group. Exogenous addition of p-FGF2 or e-FGF2 exhibited similar effects on proliferation, mineralization, and osteogenic marker expression in MC3T3-E1 cells. Together, the current findings support the usefulness of this plant-based expression system for the production of biologically active rhFGF2.

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Supplementary Fig. 1. Screening of transformed callus lines expressing high levels of p-FGF2. The amount of p-FGF2 was determined by ELISA as described in the Materials and Methods. (TIFF 644 kb)
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Supplementary Fig. 2. Time-course study of rhFGF2 production in transgenic rice suspension culture medium by direct ELISA. The selected rice cell line (KF40-14) was propagated in sucrose-contained N6 medium and after 9 days of incubation, the medium was replaced to sucrose-free new N6 medium followed by 19 day additional incubation. At the indicated days of incubation, the level of rhFGF2 proteins was monitored by ELISA. (TIFF 890 kb)
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Supplementary Fig. 3. Silver staining and Western blot data of p-EGF2 and e-FGF2. The size of p-FGF2 was determined according to silver staining (A) and Western blotting methods (B) by loading 1 μg of the protein (purity > 98%), where e-FGF (1 μg, Prospec CYT-218) was used as positive control. Sliver staining was performed under 14% Tricine reducing condition, while, in immunoblotting, anti-hFGF2 antibody (MyBioSource.com, MBS175351, 2 μg/10 ml) and anti-rabbit IgG antibody were used as 1st and 2nd antibodies, respectively. M, molecular size marker; P, positive control; R, p-FGF2 (original size: 17.2 kDa). (TIFF 2180 kb)
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Supplementary Fig. 4. The procedures for surgery and ACS implantation. (A) Mice received surgical operation to create calvarial bone defect before implantation with ACS loaded with DPBS, p-FGF2, or e-FGF2. Panels B and C show circular bone defect (4 mm in diameter) at the middle of the sagittal suture and ACS, respectively. (TIFF 3845 kb)
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