Molekulare Pathogenese der Fibrose bei Muskeldystrophie vom Typ Duchenne

Das am häufigsten im menschlichen Körper auftretende Protein ist das Kollagen. Die Vielzahl an Genen, welche verschiedene Formen von Kollagen exprimieren und die Fülle von Isoformkombinationen bilden die molekulare Basis einer hochkomplexen Proteinfamilie dieser extrazellulären Komponenten. Die hohe Abundanz und ausgeprägte Komplexität der Kollagene unterstreicht die strukturbiologische Bedeutung des Bindegewebes und der extrazellulären Matrix [1]. Genetische Muskelerkrankungen mit primären Defekten in spezifischen Kollagenen sind die Bethlem-Myopathie und die kongenitale Muskeldystrophie Typ Ulrich mit einer spezifischen Defizienz im Kollagen VI [2]. Im Gegensatz zum genetisch verursachten Verlust von Kollagen bei der kongenitalen Muskeldystrophie [3] kann bei einer progredienten Muskelschädigung die pathobiochemische Akkumulation dieses extrazellulären Proteins eine reaktive Myofibrose verursachen [4]. Es ist noch unklar, ob die Ausbreitung des Bindegewebes bei progressiven Muskeldegenerationen als eine weitgehend unregulierte Begleiterscheinung auftritt oder aktiv mithilfe von Signalmolekülen gesteuert wird. Die Ablagerungen von Kollagenmolekülen und anderen extrazellulären Komponenten sind möglicherweise eine relativ unspezifische Adaptation bei zellulärer Schädigung. Die gesteigerte Synthese von Kollagen dient dabei der allgemeinen Verhinderung eines Volumenverlustes im Gewebeverband. Dabei spielt die Proliferation von Myofibroblasten eine entscheidende Rolle bei neuromuskulären Erkrankungen [4].

Neue molekulare Erkenntnisse weisen auf eine umgestaltende Rolle spezifischer Botenstoffe [5] und Proteinmodifizierungen [6] hin, welche die Fibrose im Muskelgewebe aktiv zu beeinflussen scheinen [4]. Sekundäre myofibrotische Veränderungen sind besonders auffällig bei der X‑chromosomalen Muskeldystrophie. In späten Stadien der Muskeldystrophie vom Typ Duchenne kommt es zu einer bindegewebigen Durchsetzung der Skelettmuskulatur und des Herzens und als Folge von Muskelfaseruntergängen zum Ersatz durch Binde- und Fettgewebe [7]. Die direkte Korrelation zwischen Muskelschwäche und endomysialer Fibrose [8] macht Kollagenansammlungen im dystrophischen Skelettmuskel zu einem wichtigen pathologisch-anatomischen Anzeichen der Dystrophinopathie [9]. Im Zusammenspiel mit Muskelfaserdegeneration, Entzündungsvorgängen, oxidativem Stress und spezifischen Störungen der Kalziumhomöostase kommt es durch Kollagenablagerungen zur Ausbildung von Muskelschwund und Fibrosierung und zu einer daraus resultierenden stark progressiven Muskelschwäche.

Da die pathophysiologischen Mechanismen der Myofibrose auf komplexen sekundären Veränderungen im Skelettmuskel beruhen, bedarf es geeigneter Hochdurchsatzanalysen, um die fibrosespezifischen Veränderungen auf molekularer Ebene zu bestimmen. Die vergleichende Proteomanalyse eignet sich hierfür hervorragend. Mit ihr kann eine systematische Bestimmung von pathobiochemischen Abweichungen bei der zeitlichen Abfolge der Expression von Matrixproteinen, wie sie bei der Muskeldystrophie beobachtet wird, durchgeführt werden [10].

Das größte identifizierte Gen im menschlichen Genom ist das 2,4 Mio. Basenpaare umspannende Dmd-Gen mit 79 Exons. Mehrere Promotoren ermöglichen die Synthese verschiedener Dystrophinisoformen. Die 3 vollständigen Proteinvarianten werden mithilfe von speziellen Gehirn-, Purkinjezell- und Muskelpromotoren synthetisiert. Die Produktion kleinerer Dystrophinisoformen basiert auf den Retina-, Gehirn-/Nieren-, Schwannzellen- und Ubiquitärpromotortypen [11]. Die Existenz von mehreren Promotoren führt somit zur Synthese von mindestens 7 primären Dystrophinisoformen (Dp427-B im Gehirn, Dp427-M im Skelettmuskel und Herzen, Dp427-P in Purkinjezellen, Dp260-R in der Retina, Dp140-B/K in Gehirn und Niere, Dp116-S in Schwann-Zellen und ubiquitäres Dp71-G im Gehirn und anderen Geweben) sowie weiteren verkürzten Dystrophinmolekülen durch alternatives Spleißen (Abb. 1). Für die X‑chromosomale Muskeldystrophie ist das im Zytoskelett des Skelettmuskels und Herzens auftretende Dystrophin mit einem relativen Molekulargewicht von 427 kDa von besonderer Bedeutung. Durch die extreme Größe und komplexe Exon-Intron-Struktur ist das Dystrophingen anfällig für primäre Defekte. Die X‑gebundene Muskeldystrophie ist assoziiert mit (i) größeren Deletionen in einem oder mehreren Exons mit Verschiebung des Leserasters, (ii) verschiedenen Arten von Punktmutationen (Nonsensemutationen, Splice-Site-Mutationen, partielle Insertionen, partielle Deletionen, Missensemutationen) oder (iii) größeren Duplikationen in einem oder mehreren Exons. Diese genetischen Veränderungen resultieren gewöhnlich in der Bildung von mangelhaften Dystrophinmolekülen. Verkürzte, funktionslose und abnormale Dystrophinvarianten werden normalerweise schnell abgebaut und führen damit zu einem fast vollständigem Fehlen dieses essenziellen Strukturproteins im Membranzytoskelett des Skelettmuskels und Herzens.

Das vollständige Dystrophinmolekül im Muskel zeichnet sich durch 4 molekulare Hauptdomänen aus. Diese bestehen aus dem Aminoterminus (NT), der zentralen und langen spektrinähnlichen Domänenstruktur (SLR1-3, SLR4-19, SLR20-24), der cysteinreichen Domäne (CR) und dem Carboxyterminus (CT). Innerhalb des Moleküls befinden sich 4 prolinreiche und relativ bewegliche Zonen (H1–H4). Kontaktstellen zur Interaktion mit Aktinfilamenten und dem Enzym Stickstoffmonoxid-Synthase (nNOS) sowie den dystrophinassoziierten Proteinen β‑Dystroglykan (β-DG), Syntrophin (SYN) und Dystrobrevin (DYB) existieren im Dp427-Molekül (Abb. 1). Andere dystrophinassoziierte Proteine sind das α‑Dystroglykan (α-DG), das Sarkospan (SSPN) und die Sarkoglykane (α/β/γ/δ-SGs). Durch die enge Bindung von Dystrophin an Aktin und die spezifischen Interaktionen zwischen Laminin und dem Dystroglykankomplex kommt es zur indirekten Kopplung zwischen dem Membranzytoskelett, der Plasmamembran und der Basalmembran der extrazellulären Matrix [12]. Diese molekulare Dystrophinachse stabilisiert die Faserperipherie während der Kontraktionszyklen und Faserdehnungen und verhindert somit potenzielle Schädigungen an der empfindlichen Zellmembranstruktur unter kontinuierlicher Belastung des Muskelgewebes.

Bei der Muskeldystrophie vom Typ Duchenne kommt es durch die stark erniedrigte Konzentration des Dystrophin-Glykoprotein-Komplexes zu einer pathophysiologischen Destabilisierung der Muskelfasermembran. Mikroskopische Läsionen in der Plasmamembran führen dann zu einer Kette von physiologischen und biochemischen Störungen wie der elektromechanischen Entkopplung, dem proteolytischen Abbau von essenziellen Muskelproteinen und einem abgeschwächten Energiestoffwechsel. Ein hoher Grad von Muskelfaseruntergängen ist die Folge dieser sekundären Effekte [7]. Das typische myopathische Muster der X‑chromosomalen Muskeldystrophie besteht aus Zyklen von Faserdegeneration und Faserregeneration, einem vermehrten Auftreten von zentralliegenden Kernen, starken Kalibervariationen und Fettvakatwucherung. Somit erzeugt der Verlust von Dystrophin erhebliche strukturelle Umwandlungen im erkrankten Muskelgewebe und bewirkt im fortgeschrittenen Stadium eine reaktive Myofibrose (Abb. 2). Trotz des monogenetischen Charakters der Muskeldystrophie vom Typ Duchenne ist die Ätiologie dieser neuromuskulären Erkrankung also hoch komplex in Bezug auf Sekundärschädigungen des Muskelgewebes [8]. Die systembiologische Anwendung von Hochdurchsatzverfahren zur Auftrennung des Skelettmuskelproteoms und die Verwendung von sensitiver Massenspektrometrie hat zur Identifizierung einer Vielzahl von veränderten Proteinen bei der Muskeldystrophie vom Typ Duchenne geführt [13]. Neue vergleichende Untersuchungen haben auch entscheidend zu einem verbesserten Verständnis der Pathogenese der sekundären Myofibrose beigetragen.

Das Proteom ist definiert als die Gesamtheit der Proteine in bestimmten Zelltypen, Gewebearten oder Körperflüssigkeiten, welche in einer dynamischen Abhängigkeit von äusseren Einflüssen zu einem bestimmten Zeitpunkt vom Genom exprimiert werden. Individuelle Zellen, wie z. B. Skelettmuskelfasern, enthalten mehrere tausend verschiedene Arten von Proteinen mit ungleichen primären Peptidsequenzen und dynamischen posttranslationalen Modifikationen [14]. Diese Unterschiede verleihen individuellen Proteinen distinktive physikochemische und biologische Eigenschaften und ermöglichen so ihre effiziente Auftrennung mithilfe von Gelelektrophorese und Flüssigkeitschromatographie. Die hohe Komplexität, die dynamische Expression und das hohe Molekulargewicht vieler Proteine der extrazellulären Matrix sowie die vielfältigen Interaktionen innerhalb der verschiedenen Schichten der extrazellulären Matrix machen die systematische Proteomanalyse der Myofibrose jedoch äußerst kompliziert [15].

Basierend auf der ursprünglichen Analyse der Sequenzdaten des menschlichen Genoms, welches die Existenz von ungefähr 400 mit der extrazellulären Matrix assoziierten Proteinen voraussagte, führte die detaillierte bioanalytische Erfassung von Adhäsionsproteinen und der extrazellulären Matrix mithilfe der Proteomforschung und der Bioinformatik zu einer Gesamtzahl von über 1000 Matrixproteinen [16]. Die Hauptkomponenten der Bindegewebsschichten im Endomysium, Perimysium und Epimysium sind Kollagene, Proteoglykane und eine Vielzahl von Glykoproteinen. Assoziierte Proteingruppen sind Proteinfaktoren im Sekret (wie der transformierende Wachstumsfaktor TGF und verschiedene Zytokine), regulierende Enzyme (wie die Matrix-Metalloproteasen MMP), matrixzelluläre Proteine (wie das Periostin), Mucine und Galektine [16].

Das bioanalytische Ziel mehrerer vergleichender Proteomstudien der bindegewebigen Durchsetzung der dystrophischen Skelettmuskulatur war die Etablierung von fibrosespezifischen Veränderungen in Zusammenhang mit einzelnen Matrixproteinen [17]. Die Kombination von differenzieller Proteinmarkierung mittels Sättigungslabelling und hochauflösender 2D-Gelelektrophorese hat zur Identifizierung von extrem hohen Kollagenmengen im dystrophischen Muskel geführt [18]. Dieser Befund wurde sowohl durch andere Proteomanalysen [19, 20] als auch mithilfe der vergleichenden Immunoblotanalyse und Fluoreszenzmikroskopie bestätigt [17]. Die starke Vermehrung von Kollagenfasern und anderer Kollagenisoformen und ihre Akkumulation um einzelne Muskelfasern, Gruppen von kontraktilen Einheiten und Faszikeln führen dann zu einer ausgedehnten Fibrose in späten Stadien der X‑gebundenen Muskeldystrophie. Neben Kollagen I, Kollagen IV und Kollagen VI wurde eine erhöhte Konzentration bei einer Vielzahl von Komponenten der extrazellulären Matrix identifiziert, wie z. B. Periostin, Dermatopontin, Fibronektin, Biglykan, Asporin, Decorin, Prolargin, Mimecan, und Lumican [21‐24]. Der Anstieg dieser Proteine im Rahmen einer progredienten Myofibrose ist wahrscheinlich keine völlig unspezifische Reaktion auf die dystrophische Muskelschädigung, sondern wird durch bestimmte Signalmoleküle, Botenstoffe und Proteinmodifikationen gesteuert oder zumindest modifiziert [4‐6].

Der Anstieg von verschiedenen Proteoglykanmolekülen und matrixzellulären Proteinen ist besonders in Bezug auf ein besseres Verständnis der komplexen Pathogenese der Fibrose sowie langfristig auch für eine verbesserte Diagnostik und Therapie von Interesse. Eine Abnahme der Muskelkraft durch sekundäre Fibrosierung von Muskelgewebe tritt bei verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen auf. Im Fall der genetisch heterogenen Gruppe der Gliedergürtelmuskeldystrophien kommt es wie bei der Muskeldystrophie vom Typ Duchenne zu einer pathologischen Substitution der Muskulatur durch Fett- und Bindegewebe. Die Schwächung der Becken- und Schultergürtelmuskulatur beruht auf primären Defekten in einer großen Anzahl von Genen wie SGCA/B/D/G, APN3, DYSF, POMT1/2 und PLEC [25]. Obwohl die Schwere der bindegewebigen Durchsetzung der erkrankten Muskelgruppen bei den meisten Formen der Gliedergürtelmuskeldystrophie nicht so hochgradig ist wie bei den Dystrophinopathien, spielt die Fibrose eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer Kontraktionsschwäche und der Abnahme der Muskelmasse [26]. Vergleichende molekularbiologische und biochemische Analysen von Skelettmuskelbiopsien haben erhebliche Unterschiede in krankheitsbedingten Konzentrationsänderungen der extrazellulären Proteoglykane Biglykan und Decorin bei verschiedenen Muskeldystrophien gezeigt [27]. Dieser Befund ist wahrscheinlich auf einen unterschiedlichen Grad der Destabilisierung der Plasmamembran und der kompensatorischen Umbildung der extrazellulären Matrix bei Dystrophinopathien und Gliedergürtelmuskeldystrophien zurückzuführen. Der experimentelle Gentransfer zur Wiederherstellung von β‑Sarkoglykan konnte interessanterweise im Tierversuch eine Umkehr der fibrotischen Symptome bei der Gliedergürtelmuskeldystrophie vom Typ LGMD2E erzeugen [28]. Primärdefekte in den molekularen Komponenten des Dystrophin-Glykoprotein-Komplexes scheinen also eng mit sekundären Veränderungen in der extrazellulären Matrix verbunden zu sein. Daher könnten Proteoglykane und regulierende Matrixproteine möglicherweise als neue therapeutische Ziele bei der Behandlung der Myofibrose dienen. Ein vielversprechender Kandidat ist das matrixzelluläre Protein Periostin, welches normalerweise nur in sehr geringen Mengen im adulten Skelettmuskel und Herzen vorkommt. Bei der embryonalen Muskelentwicklung, der Faserregeneration und bei der fibrotischen Gewebeumwandlung kommt es jedoch zu einem ausgeprägten Anstieg der Konzentration von Periostin [17]. Bei entwicklungsbiologischen Prozessen und physiologischen Adaptionen ist dieser Konzentrationsanstieg nur vorübergehend, bei der Myofibrose kommt es jedoch zu einer stabilen Hochregulation dieses Proteins [22]. Dieser Befund macht Periostin zu einem vielversprechenden neuen Indikator der Myofibrose im Zusammenhang mit progressiver Muskeldystrophie. Eine erhöhte Serumkonzentration von typischen Matrixproteinen wurde weiterhin für die Isoform MMP-9 der Matrix-Metalloproteinase und das Fibronektin beschrieben [29, 30]. Der Anstieg dieser Proteine scheint mit dem Schweregrad der Muskeldystrophie zu korrelieren. Basierend auf den Befunden aus den Proteomanalysen verschiedener dystrophischer Muskeltypen und den festgestellten dynamischen Veränderungen der Proteinzusammensetzung in bestimmten Körperflüssigkeiten ergeben sich verschiedene Kollagene, Proteoglykane und matrixzelluläre Proteine als neue therapeutische Ziele (Abb. 3).