Optogenetik als mögliche Therapie bei degenerativen Netzhauterkrankungen

Als eine mögliche Lösung für dieses Problem wird an der Entwicklung von „virtual reality“ (VR) Brillen gearbeitet, die als Display ein Array aus sehr hellen LEDs benutzen. Auf diesem Display wird die Umgebung gezeigt, die von einer integrierten Kamera erfasst wird. Ein Vorteil dieses Systems besteht darin, dass die benutzten LEDs und die benötigte Helligkeit an das verwendete optogenetische Protein angepasst werden können. ChR-2 zum Beispiel hat seine maximale Empfindlichkeit gegenüber blauem Licht (ca. 470 nm), Halorhodopsin gegenüber gelbem Licht (ca. 580 nm). Unabhängig von der tatsächlichen Umgebungshelligkeit kann damit immer die optimale Anregung des therapeutischen Optogens gewährleistet werden. Außerdem lässt sich im Prinzip jede gewünschte Bildverarbeitung auf das Kamerabild anwenden, um den Seheindruck des Patienten zu verbessern. Die Verstärkung von Kontrasten im Bild könnte zum Beispiel das Erkennen von Objekten vereinfachen [18]. Allerdings umgeht dieser Ansatz nicht das Problem, dass die benötigten hohen Lichtintensitäten, insbesondere bei Wellenlängen im Bereich von 400–500 nm, auf Dauer schädlich für das Gewebe sind [7, 13].

Eine zweite Lösung des Problems ist daher die Nutzung von optogenetischen Proteinen, die das vorhandene Licht effizienter in Anregung des Gewebes umsetzen. Drei Faktoren bestimmen diese Effizienz und damit die effektive Lichtempfindlichkeit, nämlich die Expressionseffizienz, die Wahl der Zielzelle und Art der Beeinflussung der Zielzelle. Die Expressionseffizienz beeinflusst schlicht die Anzahl der vorhandenen Proteine. Eine Verdopplung der Anzahl von ChR-2 Proteinen in einer Zelle verdoppelt die Wahrscheinlichkeit, dass eines davon bei gegebener Lichtstärke ein Photon absorbiert. Da ChR-2 ein Membranprotein ist, ist eine Erhöhung der Anzahl allerdings durch die Oberfläche der Zelle beschränkt, und eine Überfrachtung der Zellmembran mit einem Fremdprotein hat negative Auswirkungen auf die Gesundheit einer Zelle. Außerdem benötigen die gegenwärtigen Ansätze nicht eine Verdoppelung der Lichtempfindlichkeit, sondern eine 1000-fache Erhöhung. Nichtsdestotrotz, die Evolution zeigt uns, dass dies im Prinzip eine sehr gewinnbringende Strategie wäre, schließlich sind die Außensegmente der Photorezeptoren genau aus diesem Grund mit Membranstapeln, den discs, vollgepackt.

Der zweite Faktor ist die Zielzelle für die optogenetische Behandlung. Durch Konvergenzeffekte innerhalb des retinalen Netzwerks steigt die effektive Lichtempfindlichkeit, wenn das optogenetische Protein mehr distal in der Netzhaut exprimiert wird. Dies ist besonders eindrücklich bei Expression in Photorezeptoren (Abb. 1c, d, Ansatz 6). Bei direkter Ableitung von den Photorezeptoren selbst konnten Antworten erst bei sehr hohen Lichtintensitäten festgestellt werden (Ansatz 6a). Durch Pooling des schwachen Photorezeptorsignals zeigten Ganglienzellen allerdings schon robuste Antworten bei deutlich geringeren Intensitäten (Ansatz 6b). Ein ähnlicher Effekt ist sichtbar beim Vergleich von ChR-2 Expression in Bipolarzellen (Ansatz 2b) vs. Ganglienzellen (Ansatz 2a).

Der dritte Faktor ist die Auswirkung auf die Zelle, wenn ein Photon absorbiert worden ist. Im Gegensatz zu Photorezeptoren, in denen das Rhodopsin über den Umweg einer Signalkaskade die Öffnung eines Ionenkanals beeinflusst, ist ChR-2 selbst ein Ionenkanal. Nach der Aktivierung durch ein absorbiertes Photon öffnet sich dieser Kanal und bleibt für eine bestimmte Zeit offen. Die Länge dieser Öffnungszeit ist eine Stellschraube zur Regulierung bei ChR-2: Je länger anhaltend die Öffnung des Kanals, desto größer ist die Auswirkung auf das Membranpotenzial der Zelle. Allerdings ist diese Öffnungszeit eine inhärente Eigenschaft des Proteins selbst. Es gibt verschiedene Varianten von Channelrhodopsin, bei denen diese Zeit kürzer oder länger ist als beim ursprünglich beschriebenen ChR-2 (von wenigen Millisekunden bis viele Minuten). Zur Erhöhung der Effizienz eignen sich zur Therapie im Auge also eher die Varianten, die eine etwas längere Öffnungszeit haben, ohne jedoch zu träge auf Lichtänderungen zu reagieren. Eine zweite inhärente Kanaleigenschaft, die sich auf die effektive Lichtempfindlichkeit auswirkt, ist die Permeabilität gegenüber bestimmten Ionen. So hat die Channelrhodopsin-Variante CatCh eine erhöhte Permeabilität für Kalziumionen; erhöhter Kalziumeinstrom verstärkt mittels sekundärer Effekte die Reaktion der Zelle auf den Lichtreiz [8]. Diese beiden Ansätze – Öffnungszeit und Ionenspezifizität – reichen aber immer noch nicht aus, die gewünschte Sensitivität zu erzielen. Eine dritte inhärente Eigenschaft ist die spektrale Empfindlichkeit. ChR-2 selbst hat seine höchste Empfindlichkeit im Blaubereich (470 nm). Solch kurzwelliges Licht führt aber schnell zu phototoxischen Effekten auf das bestrahlte Gewebe [17]; langwelligeres Licht hat einen deutlich höheren Gefahrengrenzwert (Abb. 1d, schwarze Linie). Channelrhodopsine mit rot-verschobenem Spektrum eignen sich daher eher zur Therapie. Zwar führt dies nicht an sich zu einer erhöhten Sensitivität, allerdings sind die benötigten hohen Lichtintensitäten weniger schädlich für das Auge. Die Arbeitsgruppen um Deniz Dalkara und Jens Dübel in Paris haben kürzlich die Eignung der Channelrhodopsinvariante ReaChR untersucht (Abb. 1c, d, Ansatz 7; [13]). Deren Anregung war mit Lichtintensitäten möglich, die sich zwar nicht sehr von ChR-2 unterschieden, aber dennoch deutlich unterhalb des im Rotbereich höheren Sicherheitsgrenzwertes lagen. Außerdem konnten sie zeigen, dass sich ReaChR in Primatenretina exprimieren und anregen lässt, inklusive menschlicher Netzhaut.

Eine weitere Art der Zellbeeinflussung besteht darin, dass man sich vorhandene Signalkaskaden in der Netzhaut zunutze macht und dafür optogenetische Alternativen zu ChR-2 entwickelt, die sich speziell für Therapieansätze in der Netzhaut eignen. Vorbild sind hier die gesunden Photorezeptoren, bei denen jedes aktivierte Rhodopsin eine Signalkaskade anstößt, die relativ lang anhaltend zur Schließung von Membrankanälen und letztlich zur robusten Hyperpolarisation des Photorezeptors führt. Die Absorption des Photons ist also nur der Auslöser der Signalkaskade. Eine Signalkaskade mit mehreren Schritten hat einen weiteren Vorteil: Viele Schritte bedeuten viele Stellschrauben, mit denen die Gesamtverstärkung des Signals reguliert werden kann. Diese Adaptation ist der Hauptgrund dafür, dass die gesunde Netzhaut über einen riesigen Helligkeitsbereich hinweg funktioniert. Auch bei optogenetischen Ansätzen führt das Andocken an existierende Signalkaskaden zu Signalverstärkung. Außerdem greifen automatisch die vorhandenen Regulierungsmechanismen der Kaskade, sodass ein gewisses Maß an Adaptation erzielt wird. Zwei Beispiele sollen hier vorgestellt werden.

Das Team um Rob Lucas in Manchester und, unabhängig davon, ein Team um John Flannery aus Berkeley, exprimierten das Stäbchen-Rhodopsin ektopisch in nachgeschalteten Verarbeitungsschichten degenerierter Netzhaut, wodurch erfolgreich Lichtantworten erzeugt wurden (Abb. 1d, Ansatz 4; [4, 6]). Offensichtlich kann sich Rhodopsin auch in anderen Zellen, nicht nur in den Photorezeptoren, in G‑Protein-gekoppelte Signalkaskaden einklinken und lichtgesteuerte Antworten auslösen. Es ist bekannt, dass Rhodopsin aufgrund des Ausbleichens grundsätzlich Nachschub an Retinal (das Licht absorbierende Chromophor des Opsins) benötigt, was normalerweise über den engen Kontakt zwischen den Photorezeptoren und der Pigmentepithelschicht gewährleistet wird. Überraschend war, dass die Antworten ohne externe Zugabe von Retinal in vivo über längere Zeit stabil blieben. Das in der Netzhaut dieser Degenerationsmauslinie noch zur Verfügung stehende Retinal reichte also offensichtlich zur Regeneration aus. Allerdings sind diese Ergebnisse nicht ausreichend, um Rückschlüsse auf den Therapieerfolg beim Menschen zuzulassen. Das Problem des Ausbleichens bleibt insoweit ungeklärt, und explizite Studien zur Regeneration des Rhodopsin in dieser Therapievariante werden nötig sein. In diesen Studien wurden zwei verschiedene Expressionsstrategien in rd1-Mäusen verwendet, zum einen eine unspezifische Expression in allen Zelltypen der Netzhaut (hierbei wurden überwiegend die inneren Schichten der Netzhaut erreicht), zum anderen eine ON-bipolarzellspezifische Expression. Beide Herangehensweisen führten sowohl in den Ganglienzellen als auch im Thalamus zu einer Wiederherstellung der Lichtantworten. Verhaltensversuche zeigten, dass die spezifische Expression in ON-Bipolarzellen einen Seheindruck mit besserem räumlichen Auflösungsvermögen ermöglichte.

Die Arbeitsgruppe von Sonja Kleinlogel in Bern hat ein komplett neuartiges optogenetisches Konstrukt entwickelt, Opto-mGluR, das sich die Signalkaskade der ON-Bipolarzellen zunutze macht [16]. Diese Kaskade wird normalerweise vom Glutamatrezeptor mGluR6 aktiviert, der auf das von Photorezeptoren ausgeschüttete Glutamat reagiert. Das neu entwickelte Opto-mGluR ist ein chimäres Membranprotein, dessen intrazellulärer Anteil aus den entsprechenden Peptidsequenzen von mGluR6 besteht und daher an die Signalkaskade andocken kann. Der Rest des Proteins besteht aus den entsprechenden Peptidsequenzen von Melanopsin, ein natürlicherweise in der Netzhaut vorkommendes Opsin. Lichtaktivierung des Melanopsinanteils führt nun in der Tat zu einer Aktivierung der Signalkaskade. Zwar ist das Absorptionsspektrum von Melanopsin, vergleichbar mit ChR-2, im blauen Bereich, allerdings reichte hier bereits eine 1000-fach geringere Aktivierungsenergie (Abb. 1c, d, Ansatz 3). Vermutlich liegt diese erhöhte Effizienz tatsächlich daran, dass Opto-mGluR die G‑protein gekoppelte Signalkaskade in ON-Bipolarzellen aktiviert, die zu einer deutlichen Verstärkung des Signals führt. Interessanterweise führt die Aktivierung des Opto-mGluR Proteins zu invertierten Signaleigenschaften in ON-Bipolarzellen im Vergleich zum normalen Zustand. Die Kaskade wird mittels Opto-mGluR durch Licht aktiviert. In der gesunden Netzhaut hingegen ist die Kaskade bei Dunkelheit aktiv (aufgrund des dann hohen Glutamatausstoßes der Photorezeptoren) und wird durch Licht abgeschaltet. Nichtsdestotrotz erreichte man mithilfe von Opto-mGluR die Wiederherstellung der Sehleistung in der Retina, bei der (wenn auch invertiert) sowohl ON- als auch OFF-Antworten abgeleitet werden konnten. Darüber hinaus waren die Lichtantworten auch in kortikalen Arealen (V1) zu finden. Die behandelten Mäuse zeigten sowohl den optomotorischen Reflex als auch Lernverhalten auf visuelle Stimuli im Schwimmtank. Bei diesen Verhaltensversuchen waren moderate Helligkeiten ausreichend, um visuell gesteuertes Verhalten auszulösen.

In beiden Studiendesigns wurden lichtempfindliche Proteine verwendet, die natürlicherweise in der Netzhaut vorkommen (Rhodopsin) oder aus natürlich vorkommenden Proteinanteilen zusammengesetzt sind (Melanopsin bei Opto-mGluR). Gerade hinsichtlich zukünftiger klinischer Studien und Anwendungen ist dies sehr von Vorteil, da das Risiko von Immunreaktionen reduziert ist. Beide Ansätze konnten das Problem der übermäßig hohen Lichtintensitäten überwinden und erweitern durch die Ankopplung an G‑protein-Kaskaden die Adaptationsfähigkeit. So wurde die Empfindlichkeitsbreite von 2–3 (bei ChR-2) auf 4–6 Größenordnungen ausgedehnt. Allerdings ist die Anpassungsbreite damit immer noch ein Stück von der natürlichen entfernt.