Von der Karzinogenese zur personalisierten Therapie: der Einsatz von patientenabgeleiteten Organoiden beim Pankreaskarzinom

Zweidimensionale Monolayer-Zelllinien in Plastikschalen sind einfach kultivierbar, genetisch und phänotypisch stabil, kosteneffizient, genetisch modifizierbar und optimal für Hochdurchsatz-Screenings skalierbar. Wesentliche Nachteile sind der Verlust der intratumoralen Heterogenität infolge von genetischem Drift und adaptiver Selektion in Langzeitkultur sowie das Fehlen von Stroma und gewebespezifischer Architektur [9].

Genetisch veränderte Mausmodelle (GEMM) des PDAC können die genetische und biologische Krankheitsentwicklung abbilden und spielen eine wichtige Rolle in der Untersuchung von Karzinogenese, Tumorprogression, Tumorbiologie, Tumormikroumgebung (TME) und Metastasierung. Sie entstehen durch gewebespezifische Einführung onkogener Mutationen oder Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (Knock-in- oder Knock-out-Mäuse). So war das KC-Modell (Kras^LSL-G12D; Pdx1-Cre) das erste GEMM, das eine pankreasspezifische onkogene KRAS-Aktivierung induzierte und so die langsame Progression von präinvasiven pankreatisch-intraepithelialen Neoplasien (PanIN) zum invasiven PDAC abbildeten [10]. Das nachfolgende KPC-Modell (Kras^LSL-G12D; Trp53^LSL-R172H; Pdx1-Cre) mit einer zusätzlichen p53-Mutation zeigte ein aggressiveres Krankheitsbild mit schneller Progression zum PDAC und spiegelte so humane PDAC besser wider [11].

Trotz ihres hohen wissenschaftlichen Nutzens sind GEMM in der Entwicklung langwierig, in der Haltung kosten- und zeitintensiv und erfassen nicht die intratumorale Heterogenität von humanen Karzinomen.

Dem gegenüber stehen patientenabgeleitete Xenograft-(PDX)-Modelle, die durch subkutane oder orthotope Implantation humaner Tumorfragmente in immungeschwächte Mäuse etabliert werden. Diese bewahren im Gegensatz zu GEMM die intratumorale Heterogenität sowie patientenspezifische genetische und histologische Differenzierungsmerkmale. PDX-Modelle reproduzieren die komplexen Wechselwirkungen zwischen Tumor und TME und korrelieren mit dem Therapieansprechen sowohl in PDX-abgeleiteten Organoiden [12] als auch bei Patienten [13]. Allerdings ist die Etablierungszeit mit durchschnittlich 14 Wochen von Engraftment bis zur Wirkstoffexposition lang, und nur etwa 65 % der Tiere entwickeln Tumoren [13]. Die Generierung von PDX-Modellen ist somit äußerst zeit-, arbeits- und kostenintensiv und für systematische Hochdurchsatz-Wirkstofftests ebenfalls ungeeignet.

Zur Überwindung der Limitationen von Standard-2-D-Zellkulturen und In-vivo-Modellen haben sich in den letzten Jahren PDOs als vielversprechendes präklinisches Modell etabliert [9, 14]. Organoide sind dreidimensionale Zellkulturen, die Gewebearchitektur und -funktion des Ursprungsgewebes rekapitulieren und sich zunehmend als wichtiges Modell in der Grundlagenwissenschaft und translationalen Forschung erwiesen haben. Seit der Etablierung selbstorganisierender Krypten-Villus-Einheiten und Kolonorganoide durch Sato et al. 2009 [15] hat sich das Forschungsgebiet substanziell weiterentwickelt. Heutzutage existieren zahlreiche Protokolle zur Isolierung und Kultivierung von PDOs für unterschiedliche Tumorentitäten inklusive Pankreaskarzinom [14, 16].

PDOs sind dreidimensionale Zellkulturen, die aus dem Tumormaterial eines Patienten gewonnen werden. PDOs bilden die morphologischen, genetischen und epigenetischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumors nach und spiegeln die intratumorale Heterogenität wider [17, 18]. Beim Pankreaskarzinom können solche Organoidkulturen sowohl aus dem Primärtumor als auch aus Metastasen etabliert werden – etwa durch chirurgische Resektion, endosonographische Feinnadelpunktion oder perkutane Biopsie. Zudem lassen sich PDOs aus Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise zirkulierenden Tumorzellen im Blut [19], Aszites oder Pleuraerguss anzüchten [20]. Zur Isolierung von Organoiden wird das Tumormaterial des Patienten mechanisch und enzymatisch aufgespalten und in eine Matrix eingebettet, die die extrazelluläre Umgebung nachahmt. Ein spezielles Kulturmedium, das verschiedene Wachstumsfaktoren erhält, fördert das dreidimensionale Wachstum. Nach erfolgreicher Etablierung können die Organoidlinien längerfristig expandiert und kryokonserviert werden. Der Erfolg einer solchen Kultur hängt u. a. von der Qualität des Ausgangsmaterials, der Entnahmemethode, dem Tumorzellanteil und dem Behandlungsstatus des Patienten ab und liegt meist zwischen 41 und 78 % [20‐22]. Die Zeitspanne von der Biopsie bis zum Vorliegen der Ergebnisse von Medikamententests variiert ebenfalls in Abhängigkeit von Ausgangsmaterial, Isolationsmethodik und Substanztestung und beträgt 32–96 Tage [20‐22].

Der häufigste histologische Subtyp des exokrinen Pankreaskarzinoms ist das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC). Die Entwicklung von Vorläuferläsionen zum invasiven Adenokarzinom folgt einem sequenziellen Progressionsmodell, das durch die schrittweise Akkumulation genetischer Aberrationen und zytologischer Atypien geprägt ist, vergleichbar mit der Adenom-Karzinom-Sequenz im Kolon. Ein invasives Karzinom entsteht überwiegend (85–90 %) aus mikroskopischen Vorläuferläsionen, den PanIN, seltener (10–15 %) aus makroskopisch zystischen Läsionen wie den intraduktalen papillär-muzinösen Neoplasien (IPMN) oder muzinös-zystischen Neoplasien (MCN). Sowohl azinäre als auch duktale Zellen können als Ursprungszellen für das PDAC dienen. Bei der azinär-zu-duktalen Metaplasie (ADM) kommt es zu einer Dedifferenzierung pankreatischer Azinuszellen und ihrer Transdifferenzierung in progenitorähnliche Zellen mit duktalen Eigenschaften, meist als Reaktion auf eine Verletzung oder Entzündung, die zur PanIN führen kann. Duktale Zellen gelten als typische Vorläuferzellen von IPMN.

Die Progression zum Karzinom erfolgt schrittweise durch den Erwerb onkogener Mutationen und den Verlust von Tumorsuppressorgenen. KRAS-Mutationen stellen dabei das initiierende Ereignis dar, bei IPMN können zusätzlich GNAS-Mutationen und der Verlust des Tumorsuppressors RNF43 auftreten. Der Verlust von CDKN2A und später TP53 und SMAD4 fördern die schrittweise Transformation zum invasiven Karzinom [23].

Um die Progression von IPMN in invasive Karzinome zu untersuchen und mögliche Präventionsstrategien zu entwickeln, etablierten Beato et al. eine Biobank von PDOs aus IPMN und angrenzendem normalem Pankreasgewebe. Die IPMN-PDOs konnten dabei die morphologischen und genetischen Profile der ursprünglichen IPMN-Tumoren nachbilden [24]. In einem ähnlichen Ansatz identifizierte eine weitere Studie mittels Transkriptomsequenzierung 28 Gene, die zwischen normalen Pankreasgang-PDOs und IPMN-PDOs unterschiedlich exprimiert wurden. Der Verlust der FOXA1-Expression in niedriggradigen IPMN, MCN und PDAC im Vergleich zu normalen Pankreasgängen deutete darauf hin, dass FOXA1 bereits früh in der pankreatischen Tumorentstehung verloren geht und unterstreicht damit den Nutzen von Organoidkulturen, um Genetik und Biologie von IPMN zu untersuchen [25]. Schneider et al. untersuchen anhand muriner und humaner Organoidkulturen die Rolle des programmierten Zelltods während der KRAS-getriebenen ADM in der Entwicklung zum PDAC [26]. Sie konnten zeigen, dass die pharmakologische Hemmung von „transforming growth factor (TGF)-β-activated kinase 1“ (TAK1) in den Organoiden einen programmierten Zelltod induzierte und somit ein potenzielles Target für die Prävention und Therapie von PDAC darstellt.

Solche Organoidmodelle bieten die Möglichkeit, die Progression von Vorläuferläsionen zum invasiven Karzinom zu erforschen und darauf basierende Präventionsstrategien abzuleiten.

Die Substanztestung von Organoiden hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Das Ziel einer solchen Pharmakotypisierung ist es, die effektivste Therapie für den individuellen Patienten vorherzusagen und gleichzeitig Toxizität von nicht wirksamen Substanzen einzusparen.

In einer wegweisenden Arbeit von Tiriac et al. aus dem Jahr 2018 wurde erstmals gezeigt, dass Organoide das Therapieansprechen beim Patienten vorhersagen können [18]. 40 PDOs von PDAC-Patienten, die das Mutationsspektrum und den transkriptomischen Subtyp der Primärtumoren widerspiegelten, wurden mit 5 Standardchemotherapeutika (Gemcitabin, Paclitaxel, Irinotecan/SN-38, 5‑Fluorouracil und Oxaliplatin) behandelt. Anhand der Fläche unter der Kurve (AUC) wurden die PDOs in Terzile eingeteilt und als sensibel (niedrigste 33 % AUC), intermediär resistent (mittlere 33 % AUC) oder resistent (höchste 33 % AUC) klassifiziert.

Retrospektive Analysen von 9 PDAC-Patienten zeigten, dass die in vitro ermittelten Sensitivitätsprofile das klinische Ansprechen der Patienten zuverlässig widerspiegelten. In den nachfolgenden Jahren demonstrierten weitere Arbeiten den Nutzen von PDOs in der Therapieprädiktion. In einer prospektiven Machbarkeitsstudie an unserem Zentrum in Ulm wurden 28 PDOs von PDAC-Patienten pharmakotypisiert und anhand von AUC-Werten nach der Jenks-Natural-Breaks-Klassifikationsmethode in hohe, mittlere oder niedrige Ansprechraten eingeteilt [27]. Dieses Vorhersagemodell prognostizierte korrekt das Therapieansprechen bei 91 % der chemotherapienaiven Patienten für die Erstlinie und bei 80 % der vorbehandelten Patienten für die Zweitlinie. Die prospektive HOPE-Studie schloss 76 PDAC-Patienten ein und zeigte bei allen 12 Patienten, für die klinische Ansprechdaten vorlagen, eine positive Korrelation zwischen den PDO-Sensitivitätsprofilen und dem radiologischen Ansprechen [28]. In einer Studie von Deyman et al. wurden PDOs von 117 Patienten mit resektablem PDAC generiert, um das Ansprechen auf eine neoadjuvante Therapie vorherzusagen. Es zeigte sich eine hohe Übereinstimmung zwischen der organoidbasierten Chemosensitivität sowie dem pathologischen und klinischen Therapieansprechen. Interessanterweise spiegelte ein longitudinaler Patient mit PDOs vor und nach neoadjuvanter Therapie den Erwerb einer Resistenz gegenüber Gemcitabin/nab-paclitaxel wider, was unter fortgesetzter adjuvanter Therapie mit diesem Schema zu einem frühen Rezidiv beim Patienten führte [29]. Ähnliche Beobachtungen machten Farshi et al., die 5 prä- und 5 post-neoadjuvant behandelte PDAC-PDOs untersuchten. Nach neoadjuvanter Therapie mit FOLFIRINOX zeigten die post-neoadjuvant behandelten PDOs den Erwerb einer Resistenz gegenüber diesem Regime. Diese Daten deutet darauf hin, dass PDOs die Entwicklung von Resistenzen abbilden können und dass möglicherweise nicht alle Patienten von einer adjuvanten Fortführung derselben neoadjuvanten Therapie profitieren [30]. In ein noch nicht peer-reviewtes Preprint wurden 169 Patienten einbezogen und 83 PDAC-Organoidlinien pharmakotypisiert. Bei 73,4 % (46 Patienten) der PDAC-Patienten gelang eine korrekte Therapievorhersage. Insbesondere führte die Anwendung einer als wirksam prognostizierten Therapie im palliativen Setting zu einem signifikant längeren progressionsfreien Überleben (Median: 79 vs. 56 Tage) [22].

Zur Validierung dieser überwiegend aus Beobachtungsstudien stammenden positiven Signale laufen derzeit zahlreiche prospektive randomisierte klinische Studien beim Pankreaskarzinom. Diese untersuchen u. a. die Durchführung von Wirkstofftests, die Korrelation des in vitro Therapieansprechens mit dem Therapieansprechen beim Patienten, den Zusammenhang mit genomischen Mutationen sowie den Nutzen einer pharmakotypisierungsbasierten Therapieentscheidung. Beispielsweise werden derzeit in der UNITEPANC-Studie der Arbeitsgemeinschaft Internistische Onkologie (AIO) sowie in randomisierten Phase 3 Studien der potenzielle Nutzen einer organoidbasierten adjuvanten Therapie beim resektablen PDAC (NCT04931394) sowie einer organoidbasierten palliativen Therapie beim fortgeschrittenen PDAC (NCT04931381, NCT05842187) untersucht.

Die Differenzierung zwischen pankreatikobiliären Karzinomen sowie benignen Erkrankungen stellt in der klinischen Praxis häufig eine diagnostische Herausforderung dar. PDOs spielen nicht nur in der Karzinogenese und Therapieprädiktion eine wichtige Rolle, sondern können auch als komplementäres diagnostisches Werkzeug Anwendung finden. So konnten beispielsweise Multi-Omics-Analysen von PDOs aus pankreatikobiliären Tumoren zeigen, dass das Expressionsmuster auf Einzelzell-Ebene eine Unterscheidung von Pankreas- und Gallenblasenkarzinomen ermöglicht [31]. In einer weiteren Studie wurden aus dem Überstand von Organoidkulturen Vesikel-Proteinmarker identifiziert, die als Biomarker im Serum eine Abgrenzung von PDAC-Patienten gegenüber Patienten mit benignen gastrointestinalen Erkrankungen erlauben [32].

Auch für die Entdeckung neuer Wirkstoffe bzw. Wirkstoffkombinationen und für „drug repurposing“ bereits zugelassener Substanzen stellen PDOs ein nützliches präklinisches Modell dar. So wurden in einer Studie von Boileve et al. PDOs von Patienten mit therapierefraktärem, fortgeschrittenem PDAC isoliert und 25 zugelassene Antitumortherapien getestet [20]. In 91 % der Fälle konnte mindestens ein wirksames Medikament identifiziert werden, was potenzielle neue therapeutische Optionen für diese therapierefraktäre Kohorte eröffnete. Patienten, die eine als wirksam vorhergesagte Therapie erhielten, zeigten ein verlängertes progressionsfreies Überleben im Vergleich zu jenen, die ein nicht wirksames Regime erhielten. Darüber hinaus konnten Synergien zwischen Kombinationstherapien, wie etwa Anti-EGFR- und KRAS^G12D-Inhibitoren, identifiziert werden [20].

Eine zentrale Herausforderung ist die unzureichende Standardisierung innerhalb und zwischen Forschungslaboren. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Zusammensetzung des Kulturmediums die Ergebnisse der Pharmakotypisierung beeinflusst [33]. Ebenso kann der Einsatz gentechnisch veränderter Zellen zur Herstellung konditionierter Medien mit biologisch aktiven Wachstumsfaktoren (z. B. L‑WNT3A oder RSPO1) zu Chargenschwankungen in der Organoidkultur führen. Ein weiteres Problem stellen Basalmembranextrakt-Matrizes aus Mausgewebe dar, deren Proteinkonzentration und Zusammensetzung ebenfalls zwischen Chargen und Herstellern variieren kann. Darüber hinaus erschweren Unterschiede in Überlebensassays (z. B. Zellviabilitäts- oder Zytotoxizitätsassays, Live-Cell-Imaging-basierte Methoden), Datenanalyse (AUC, IC₅₀, GI₅₀) sowie Interpretation von Substanztestungen (Grenzwerte auf Basis von AUC-Terzilen, Clusterverfahren wie Jenks-Natural-Breaks oder definierte Schwellenwerte) die Vergleichbarkeit zwischen Studien erheblich. Standardisierte kommerzielle Medien und synthetische Hydrogele sowie einheitliche Assay- und Analyseverfahren sind hier dringend notwendig, um die Vergleichbarkeit zwischen Studien zu verbessern.

Eine weitere wichtige Limitation rein neoplastischer Organoidkulturen besteht darin, dass sie zwar zell-intrinsische Resistenzmechanismen widerspiegeln, jedoch das TME fehlt und dadurch vermittelte nicht-zell-autonome Resistenzmechanismen nicht abgebildet werden. Das TME macht beim PDAC etwa 90 % der Tumormasse aus. Es besteht aus einer dichten extrazellulären Matrix, nicht malignen Zellen (u. a. Fibroblasten, Adipozyten, Endothelzellen, Immunzellen) sowie Wachstumsfaktoren und Zytokinen. Interstitieller Druck, Gefäßkollaps und Hypoperfusion vermindern die Diffusion von Chemotherapeutika, während Zell-Zell-Interaktionen Chemoresistenz fördern. Diese Effekte wurden beispielsweise in einer Kokultur mit tumorassoziierten Fibroblasten (CAF) demonstriert. Hier wurde eine erhöhte Expression von epithelial-mesenchymale Transition-(EMT)-Genen sowie eine damit einhergehende verminderte chemotherapieinduzierte Zellsterblichkeit von PDAC-Organoiden beobachtet [34]. Lai et al. entwickelten ein noch realitätsnäheres Modell: ein perfundierbares Gefäßsystem, in dem PDOs, Endothelzellen und Fibroblasten gemeinsam kultiviert wurden. Die Perfusion von Gemcitabin durch das Gefäßnetz war weniger wirksam als die direkte Behandlung der Tumororganoiden, was die verminderte Diffusion von Gemcitabin durch das Stroma illustriert [35]. Zunehmend werden in Studien neben Fibroblasten und Endothelzellen weitere Zelltypen wie beispielsweise Immunzellen und Nervenzellen integriert, um noch komplexere zelluläre Interaktionen nachzubilden. Der Einsatz mikrofluidischer Zellkultursysteme mit Integration biophysikalischer Faktoren erlaubt zudem eine realitätsnähere Nachbildung physiologischer Bedingungen.