Allosterische Kinaseinhibitoren

Die unerwartete Identifizierung einer allosterischen Bindungstasche in der Kinasedomäne von BCR-ABL1, die an einer anderen Stelle lokalisiert ist als das aktive Zentrum, an das Imatinib und seine Nachfolgemedikamente binden, bot eine alternative Strategie zur Hemmung der Aktivität von Imatinib-resistenten BCR-ABL1-Mutanten [8]. Die molekularen dreidimensionalen Strukturen der autoinhibierten protoonkogenen c‑ABL-Kinase zeigten interessanterweise eine intramolekulare Bindung des N‑terminalen Myristoylschwanzes von c‑ABL an einer tiefen hydrophoben Tasche in der Kinasedomäne [8, 14, 15]. Myristoylierung ist eine hauptsächlich kotranslationale kovalente Modifikation, bei der die gesättigte Fettsäure Myristinsäure mit einem Glyzinrest am N‑Terminus eines Proteins verbunden wird [19]. Der Prozess der Myristoylierung findet bei mehr als 100 Proteinen statt und lokalisiert Proteine klassischerweise an intrazelluläre Membranen, indem der Myristatrest in die Lipiddoppelschicht inseriert wird [17]. Im Gegensatz dazu ist der Myristatrest von c‑ABL intramolekular an dessen eigene Kinasedomäne gebunden (Abb. 1a).

Die Bindung des N‑terminalen Myristatrests bewirkt hier eine definierte Konformationsänderung in der letzten α‑Helix (αI-helix) am C‑Terminus der c‑ABL-Kinase-Domäne. Dieses Bindungsereignis führt zu einem Richtungswechsel dieser α‑Helix um 90 Grad, wodurch die SH2- und die SH3-Domänen von c‑ABL an die Kinasedomäne andocken und so die Aktivität der Kinase stark hemmen können, sog. Autoinhibition (Abb. 1a). Die Entfernung des Myristatrests aus der Bindungstasche und die sterische Blockierung der Bindungstasche durch die Einführung von Punktmutationen führt zum Verlust der autoinhibierten Konformation und daraus resultierend zu einer starken Erhöhung der Kinaseaktivität (Abb. 1a; [7]). Bei genauerer Betrachtung des strukturellen Aufbaus des BCR-ABL1-Fusionsproteins wird ersichtlich, dass BCR-ABL1 zwar durch den Verlust des ersten Exons (infolge der reziproken Translokation t(9;22)(q34;q11)) sein N‑terminales Myristat verloren hat – jedoch nach wie vor die (nun wahrscheinlich leere) Myristoyl-Bindungstasche behalten hat (Abb. 1b). Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass chemische Liganden und potenzielle Arzneistoffe, die an die Myristattasche binden können, den durch die BCR-ABL1-Fusion bedingten Verlust der autoinhibierenden Mechanismen von c‑ABL reproduzieren könnten (Abb. 1b; [8]). Folglich könnte BCR-ABL1 unter Ausnutzung dieses cleveren Mechanismus allosterisch gehemmt werden. Da eine solche Substanz weit entfernt von den Mutationsstellen binden würde, die zur Resistenz z. B. gegenüber Imatinib führen, sollte ein solcher Wirkstoff auch mutierte Formen von BCR-ABL1 stark und u. U. komplett inhibieren können. Ein solcher allosterischer Inhibitor würde dann einen neuen alternativen Angriffspunkt zusätzlich zum aktiven Zentrum des BCR-ABL1-Enzyms darstellen.

Aber wie kann man nun solche allosterischen Inhibitoren der Myristattasche finden? Die Arbeitsgruppe von Nathanael Gray (Genome Institute of the Novartis Foundation, San Diego, jetzt am Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA) setzte hierfür einen innovativen Hochdurchsatz-Screen ein, bei denen BCR-ABL1 exprimierende murine Prä-B-Zellen (sog. Ba/F3-Zellen) als Indikatorzellen verwendet wurden. Zunächst wurden Moleküle identifiziert, die selektiv BCR-ABL-abhängiges Zellwachstum inhibieren. Solche Moleküle zeichneten sich dadurch aus, dass sie zwar das Wachstum von Ba/F3-Zellen mit BCR-ABL1, nicht aber Ba/F3 Zellen ohne BCR-ABL1 inhibierten. Danach wurden alle bekannten molekularen Gerüststrukturen aussortiert, die man von bekannten konventionellen Kinaseinhibitoren kannte. Dies führte zur Identifizierung einer einzigen molekularen Leitstruktur, von denen ein Derivat, welches GNF-2 genannt wurde, für die weiteren Experimente verwendet wurde [1].

Bindungsstudien zeigten zunächst, dass es sich bei GNF-2 in der Tat um einen nicht ATP-kompetitiven, also allosterischen Inhibitor handelt. Des Weiteren konnte die Binding von GNF-2 an die Kinasedomäne von ABL durch Punktmutanten, welche die Bindung von Myristat an die Myristtasche blockieren, ebenfalls verhindert werden. Dies alles war starke Evidenz für die Bindung von GNF-2 an die Myristattasche [1, 8].

Wie zu erwarten, waren viele BCR-ABL1-Punktmutationen, die Resistenz gegen Imatinib vermittelten, gegenüber GNF-2 sensitiv. Unerwartet war allerdings, dass die T315I-Gatekeeper-Mutation, welche gegen alle zugelassenen BCR-ABL1-Inhibitoren außer Ponatinib resistent ist, ebenso wie eine kleine Zahl anderer Mutationen nicht durch GNF-2 inhibierbar war [1]. Dies ist insbesondere verwunderlich, wenn man bedenkt, wie weit diese Mutation von der Myristat-Bindungstasche entfernt ist und daher nicht sterisch mit der GNF-2-Bindung interferieren kann. Auf der anderen Seite wurde aber auch gezeigt dass einige Imatinib-Resistenzmutationen, insbesondere T315I, Gain-of-function-Eigenschaften haben und sowohl die enzymatische Aktivität als auch onkogene Transformation durch BCR-ABL1 erhöhen können [2, 6, 21]. Daher wurde argumentiert, dass diese Mutationen eine aktivere Konformation der ABL-Kinase-Domäne stablisieren könnten, an die Imatinib weniger gut binden kann. Da der vorgeschlagene Wirkmechanismus von GNF-2 die Wiederherstellung einer geschlossenen inaktiven und autoinhibierten Konformation von BCR-ABL1 ist (Abb. 1b), könnte diese umso schwerer etabliert werden, je aktiver die BCR-ABL1-Konformation ist.

Elegante strukturbiologische Arbeiten, welche sowohl Röntgenkristallographie, kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) und Wasserstoff-Deuterium Austauschmassenspektrometrie kombinierten, haben den Wirkmechanismus von GNF-2 und dem Zweitgenerationsinhibitor GNF-5 bestätigt [24]. Des Weiteren konnte [2, 6, 21] gezeigt werden, dass die Kombination von GNF-5 mit dem Zweitgenerationsinhibitor Nilotinib das Überleben in einem Maus-Xenotransplantationsmodell mit BCR-ABL1-T315I-exprimierenden Zellen stark verlängert [24]. In diesem Modell zeigt die Einzeltherapie mit beiden Medikamenten keine Wirkung. Diese und weitere Arbeiten, in denen GNF-5 mit weiteren BCR-ABL1-Inhibitoren kombiniert wurde, haben nun überzeugend demonstriert, dass die Kombination von klassischen ATP-kompetitiven Inhibitoren und allosterischen BCR-ABL1-Inhibitoren die Entwicklung von Resistenzen unterdrücken kann, die in der Monotherapie auftreten [4, 12]. Da dies ein besonders dringendes Problem bei der Ph-positiven B‑ALL ist, kann man hohe Erwartungen in die weitere klinische Entwicklung von allosterischen BCR-ABL1-Inhibitoren setzen.

Neben den oben beschriebenen Myristattaschen-Inhibitoren wurde in einem Hochdruchsatz-Screen eine weitere Klasse von Molekülen beschrieben, welche die ABL-Myristattasche binden können [23]. Im Gegensatz zu GNF-2/5 und ABL001 konnten die Autoren interessanterweise zeigen, dass DPH eine starker Aktivator (und nicht Inhibitor) der Kinaseaktivität von c‑ABL ist. DPH konkurrierte um die Bindung mit einem myristoylierten Peptid, welches dem N‑Terminus von c‑ABL entsprach. Strukturbiologische Analysen zeigten, dass die Bindung von DPH an die Myristattasche, im Gegensatz zu Myristat und GNF-2/5 oder ABL001, nicht mit der eingeklappten Konformation der αI-Helix kompatibel ist, sondern die ausgeklappte Konformation dieser Helix induziert (Abb. 1c). Daher aktiviert DPH die Kinaseaktivität von c‑ABL, wohingegen die BCR-ABL1-Kinase-Aktivität von GNF-2/5 und ABL001 inhibiert wird (Abb. 1b, c). Die Identifizierung von DPH und anderen c‑ABL-aktivierenden Moleküle mit demselben Wirkmechanismus sind daher sehr gute Werkzeuge, um die physiologische Funktion von c‑ABL zu untersuchen, da andere Wege, c‑ABL zu aktivieren, ineffizient und bisher nur unvollständig verstanden werden [13].

Nach Entdeckung der Bedeutung der Myristoyl-Bindungstasche für die Autoinhibition von ABL und der oben beschriebenen Identifizierung von GNF-2/5 als allosterische Inhibitoren der Kinaseaktivität von BCR-ABL1 zeigte sich jedoch eine begrenzte Wirksamkeit. So wiesen GNF-2/5 keine Aktivität gegenüber der Problemmutation T315I auf und hatten ungünstige pharmakologische Eigenschaften. Eine daraufhin mit modernen biophysikalischen Methoden durchgeführte gezielte Suche nach Molekülen mit verbesserter Wirksamkeit, Selektivität und Pharmakokinetik führte zur Identifikation von ABL001, welches hochselektiv an die Myristoyl-Bindungstasche von ABL1 bindet und eine gegenüber GNF-2 um den Faktor 100 gesteigerte Hemmung der BCR-ABL1-Kinase bewirkt, andere Kinasen dagegen nicht hemmt [22]. Diese beachtliche Spezifität von ABL001 beruht u. a. darauf, dass Myristoyl-Bindungsstellen, analog der bei ABL1 gefundenen, bei keinen anderen Kinasen existieren [14].

Die präklinische Entwicklung von ABL001 wurde u. a. in der Erwartung fortgesetzt, dass Mutationen von BCR-ABL1, die Resistenz gegenüber konventionellen TKI induzieren, keine Kreuzresistenz gegenüber allosterischen Inhibitoren haben. Somit wäre diese Substanzklasse sowohl eine therapeutische Alternative als auch ein attraktiver Kombinationspartner für katalytische TKI.

In-vitro-Untersuchungen von ABL001 (Asciminib) belegen dessen biologische Wirksamkeit gegenüber mehr als 400 BCR-ABL1-positiven Zelllinien im niedrig nanomolaren Bereich, unabhängig von der BCR-ABL1-Isoform (p210- oder p190-BCR-ABL1). Die Effektivität von ABL001 gegenüber nichtmutiertem BCR-ABL1 ist der von Zweitgenerations-TKI bei deutlich ausgeprägterer Selektivität aufgrund des anderen Wirkmechanismus vergleichbar. In Kombination mit Imatinib, Nilotinib oder Dasatinib wurde eine additive Steigerung der Wirksamkeit beobachtet [22].

Nicht unerwartet war der Nachweis einer Resistenzentwicklung bei alleiniger In-vitro-Behandlung mit ABL001. In einem Modell mit der humanen CML-Blastenkrisen-Zelllinie KCL-22 ließ sich dabei die Resistenz auf Mutationen in der Myristoyl-Bindungsdomäne (A337V) zurückführen, während keine der unter katalytischen TKI beobachteten Mutationen beobachtet wurden. Vielversprechend war auch der Nachweis, dass Zellen mit der klinisch problematischen Mutation T315I, die Resistenz gegenüber allen katalytischen TKI mit Ausnahme von Ponatinib induziert, durch ABL001 inhibiert werden. Die hierdurch gestützte Hypothese, dass die Kombination von ABL001 mit einem klassischen TKI aufgrund nicht überlappender Resistenzprofile eine Resistenzentwicklung vermeiden könnte, wurde tatsächlich in Xenotransplantationsexperimenten bestätigt: Während es unter Monotherapien mit ABL001 bzw. Nilotinib nach passagerer Tumorregression zu einem Rezidiv kam, führte eine von Anfang an durchgeführte Kombinationstherapie zu einer kompletten Remission, die selbst nach Beendigung der Therapie andauerte [22]. Somit scheint eine frühzeitige Kombination beider Substanzklassen das Herauswachsen resistenter Leukämiezellklone zumindest verringern zu können.

Die aktuellsten verfügbaren Studienergebnisse wurden auf der Jahrestagung der American Society for Hematology (ASH) im Dezember 2016 in San Diego vorgestellt [11]. Zum Zeitpunkt der Datenanalyse hatten 101 Patienten mit CML oder Ph⁺-ALL ABL001 entweder als Einzelsubstanz oder in Kombination mit einem anderen TKI erhalten. Die meisten Patienten waren ausgiebig vorbehandelt; 65 % hatten zuvor 3 oder mehr 2 TKI erhalten und 70 % der Patienten waren gegenüber dem zuletzt gegebenen TKI resistent.

Bei der Mehrzahl der Patienten (n = 73) wurde ABL001 alleine zweimal täglich per os appliziert; die Dosierung reichte von 10 bis 200 mg BID. Die maximale tolerable Dosis (MTD) wurde bislang nicht erreicht. Auch bei einmal täglicher Gabe von 80−200 mg ABL001 wurde noch keine MTD erreicht (n = 19). Nach Zusammenschau aller Daten wurden 40 mg BID als weitere Dosierung bei Patienten mit CML-CP gewählt. In den Kombinationskohorten wurden bisher erst wenige Patienten behandelt, und die Dosiseskalation wird fortgesetzt.

Bei einer Behandlungsdauer von bis zu 96 Wochen (Median 34 Wochen) zeigt sich ABL001 bislang als gut verträgliche Substanz mit signifikanter und meist dauerhafter klinischer Aktivität bei massiv vorbehandelten Patienten mit CML. Die Pharmakokinetik ist dosisproportional mit minimaler Akkumulation bei allen Dosisstufen und über die Behandlungsdauer. Die Studie rekrutiert weiterhin Patienten mit CML für Kohorten mit einmal täglicher Applikation oder Kombinatonstherapien, mit T315I-Mutationen sowie Patienten mit Ph⁺-ALL. Zahlreiche Fragen müssen in nachfolgenden Studien untersucht werden, z. B. der Stellenwert der Kombinationstherapie, die potenzielle Bedeutung von ABL001 in der Primärtherapie der CML, z. B. bei Hochrisikopatienten, und das kurative Potenzial einer ABL001 enthaltenden Therapie mit der Möglichkeit, bei einem größeren Anteil von CML-Patienten als bisher die Therapie beenden zu kennen, ohne dass es zu einem Rezidiv kommt. Die bisherigen Daten zu Wirksamkeit, Verträglichkeit und niedriger Rate von erworbener Resistenz stützen die Erwartung, dass das Prinzip der allosterischen Inhibition von BCR-ABL1 zu einer weiteren substanziellen Verbesserung der Therapie BCR-ABL1-positiver Leukämien führen wird.