Webbasierte Genexpressionsanalysen – auf dem Weg zur molekularen Entschlüsselung gesunder und erkrankter Augengewebe

Die RNA-Sequenzierung erlaubt die Entschlüsselung der Nukleotidsequenzen von Millionen von RNA-Molekülen in einer Probe [24]. Durch Vergleich dieser Sequenzen mit dem bekannten Referenzgenom können unterschiedliche RNA-Moleküle identifiziert und quantifiziert werden. Die RNA dient unter anderem als Bauplan für die Herstellung von Proteinen oder kann regulatorische Funktionen in diesem Prozess ausüben. Die Analyse des Transkriptoms bietet somit einen unvoreingenommenen Einblick in den Funktionszustand des Gewebes (Abb. 1).

Der Vergleich von Proben erkrankter und gesunder Probanden ermöglicht genaue Einblicke in die der Erkrankung zugrunde liegenden pathophysiologischen Prozesse und darüber hinaus die Identifikation neuer diagnostischer und prognostisch relevanter Biomarker. Der Erfolg des Human Genome Projects [13] und die technischen Fortschritte haben in den letzten Jahren die Kosten und den Zeitaufwand der Sequenzierung erheblich reduziert, und es ist wahrscheinlich, dass diese Entwicklung zu einer zunehmenden Anwendung der Technologie in der klinischen Diagnostik führen wird [8]. Zudem können neuerdings durch spezielle Sequenzierungsmethoden neben frischen Proben auch archivierte Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete Präparate sequenziert werden, was insbesondere die Analyse seltener Erkrankungen deutlich vereinfacht [2].

Die Transkriptomanalyse hat bisher insbesondere Anwendung in der Onkologie gefunden [7, 9, 28]. So wurden anhand von Transkriptomdaten von Lungentumoren und Kontrollgewebe diagnostische Faktoren identifiziert, auf deren Basis in einem unabhängigen Validierungsdatensatz aus über 1000 Tumoren mit einer Genauigkeit von 98 % zwischen Tumor- und Kontrollgewebe unterschieden werden konnte [9]. Auch die Differenzierung von Plattenepithel- und Adenokarzinomen der Lunge gelang in dieser Arbeit mit einer Klassifikationsgenauigkeit von 95 % [9]. Ein weiteres Anwendungsbeispiel der RNA-Sequenzierung stellt die Abschätzung der Tumorprognose anhand des Transkriptionsprofils dar. Uhlen et al. analysierten das Transkriptom von über 8000 Proben der häufigsten Tumorarten und identifizierten für jede Entität prognostisch relevante Faktoren, anhand derer eine Prognoseabschätzung gelang [28]. Auch die Vorhersage des Therapieansprechens von Tumoren stellt eine interessante und ausgesprochen praxisrelevante Anwendungsmöglichkeit der Transkriptomanalyse dar. Die molekulare Charakterisierung verschiedener Tumoren mittels RNA- und DNA-Sequenzierung ermöglichte so eine Entitäten-übergreifende Klassifikation in 4 molekulare Subtypen, welche einen prädiktiven Wert für das Ansprechen auf eine Immuncheckpoint-Inhibitor-Therapie liefert und somit Relevanz für eine zukünftige individualisierte Therapieplanung hat [7]. Eine kürzlich veröffentlichte Stellungnahme der Bundesärztekammer geht davon aus, dass in den nächsten Jahren bei einem Großteil der Tumorpatienten schon bei Erstdiagnose eine molekulare Klassifikation des Tumors erfolgt mit dem Ziel, eine möglichst präzise Therapiestrategie zu verfolgen [20].

In der Augenheilkunde hat die RNA-Sequenzierung insbesondere in der klinischen Praxis bisher vergleichsweise wenig Anwendung gefunden. Kürzlich wurde eine diagnostische Klassifikation von Plattenepithelkarzinomen und -Papillomen der Bindehaut anhand eines aus wenigen Markern bestehenden Transkriptionsprofils beschrieben [3, 15]. Zudem wurde die Genexpression von bestimmten Zellrezeptoren, die eine SARS-CoV-2-Infektion vermitteln, in Gewebe der Augenoberfläche [14] und intraokularen Geweben [16] mittels RNA-Sequenzierung untersucht. Auch Hyalozyten aus dem Glaskörper von Patienten mit epiretinaler Gliose konnten kürzlich mithilfe von RNA-Sequenzierungen als eine aktive und immunmodulatorische Zellpopulation charakterisiert werden [4]. Eine Prognoseabschätzung für okuläre Tumoren gelang für das Aderhaut- und das Bindehautmelanom [21, 32]. Das Aderhautmelanom konnte anhand des Transkriptoms in 4 prognostisch relevante molekulare Subtypen unterteilt werden [21]. Diese Klassifikation erreichte eine höhere Vorhersagekraft für das Auftreten von Fernmetastasen 5 Jahre nach einer Brachytherapie als die klassische Einteilung nach dem American Joint Committee on Cancer Staging Manual (8th Edition) [17]. Auch für das Bindehautmelanom wurden 20 prognostisch relevante Faktoren identifiziert, die eine Abschätzung des Risikos für das Auftreten eines Lokalrezidivs oder von Fernmetastasen ermöglichen [32]. Für die neovaskuläre altersabhängige Makuladegeneration (nAMD) wurden durch RNA-Sequenzierung von chorioidalen Neovaskularisationsmembranen (CNV) Calprotectin (S100A8/S100A9) sowie Secreted Phosphoprotein 1 (SPP1) als neue nAMD-assoziierte Faktoren identifiziert [22, 23, 31]. Die intravitreale Injektion eines SPP1-Inhibitors führte im murinen Laser-CNV-Modell zu einer signifikanten Modulation der CNV-Ausprägung, was die Bedeutung des Faktors als potenzielles neues Therapieziel für die nAMD unterstreicht [23].

Mit dem technischen Fortschritt, der zu einer erheblichen Zunahme von Transkriptomanalysen geführt hat, sind innerhalb der letzten Jahre große Datenbanken entstanden, die eine Vielzahl von Transkriptomdatensätzen verschiedener Erkrankungen enthalten [6, 10]. Eine der größten Datenbanken ist der Cancer Genome Atlas, welcher inzwischen die Sequenzierdaten von über 84.000 Tumorproben von 67 verschiedenen Entitäten enthält [6]. Die Vielfalt dieser Daten hat es ermöglicht, typische genetische und molekulare Veränderungen, die in verschiedenen Tumoren auftreten, zu katalogisieren, um zum einen das Wissen über jede einzelne Tumorentität zu erweitern und zum anderen das Verständnis über Entitäten-übergreifende Mechanismen der Karzinogenese zu verbessern [11]. Zudem sind die Sequenzierungsrohdaten öffentlich verfügbar und können z. B. als Validierungsdatensatz verwendet werden [9]. An dieser Stelle soll auch auf den Human Protein Atlas hingewiesen werden [27], der mithilfe einer Kombination verschiedener „Omics“-Technologien wie Massenspektrometrie oder antikörperbasierte Proteomik humane Proteine in Zellen, Geweben und Organen katalogisiert. Ungeachtet der genannten vielfältigen Möglichkeiten enthält der Cancer Genome Atlas mit Ausnahme des Aderhautmelanoms bisher keine okulären Gewebe. Obwohl effiziente Algorithmen für die Analyse der enthaltenen Sequenzierungsrohdaten existieren, erfordern diese spezielle bioinformatische Kenntnisse und sind darüber hinaus relativ zeitaufwendig. Aus diesen Gründen besteht ein Bedarf an Datenbanken, die Transkriptionsprofile okulärer Gewebe enthalten und gleichzeitig eine intuitive Datenanalyse ermöglichen.

Nachfolgend wird eine Übersicht über die verfügbaren okulären Transkriptomdatenbanken gegeben (s. Tab. 1).

Transkriptomdatenbanken wie der Cancer Genome Atlas [6] enthalten bisher kaum Augengewebe und erfordern für die Analyse der Sequenzierungsrohdaten spezielle bioinformatische Kenntnisse. Deshalb sind spezialisierte Datenbanken mit unterschiedlichem Anwendungsfokus entstanden, die Transkriptionsprofile okulärer Gewebe bereitstellen und gleichzeitig eine intuitive Datenanalyse ermöglichen. Unter den in dieser Arbeit zusammengefassten Datenbanken erlauben Spectacle, der UCSC Cell Browser und das Single Cell Portal des Broad Instituts eine intuitive Exploration von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten von Netzhaut‑, Aderhaut‑, Kornea‑, Iris‑, Trabekelmaschenwerk- und Skleragewebe. Der Human Eye Transcriptome Atlas bietet die größte Anzahl an verschiedenen Augengewebearten, enthält die meisten erkrankten okulären Entitäten und zeichnet sich durch einen hohen Qualitätsstandard aus, der durch methodische Homogenität erreicht wird. Okuläre Transkriptomdatenbanken bieten einen umfassenden und intuitiven Einblick in die Transkriptionsprofile verschiedener Augengewebe und -erkrankungen und ermöglichen somit eine unkomplizierte Hypothesenüberprüfung auf der Suche nach neuen diagnostischen und therapeutischen Zielen.