Internationaler Konsens zur ANA-Bestimmung – was ändert sich im deutschen Sprachraum?

Einleitung

Antinukleäre Antikörper (ANA) sind wesentliche Laborbefunde zur Klassifizierung von Autoimmunerkrankungen. Für die Bestimmung von ANA steht eine Reihe von Labortechniken zur Verfügung. Nach der letzten Empfehlung des American College of Rheumatology (ACR) von 2009 wird die indirekte Immunfluoreszenz (iIF) auf HEp-2-Zellen unverändert als Goldstandard empfohlen [1].

Auf der HEp-2-Zelle werden eine Vielzahl von Antigenen exprimiert, gegen die Autoantikörper gebildet werden können [2–4]. Nur ein geringer Teil dieser Autoantikörper ist auch mit bestimmten Erkrankungen (vorwiegend Autoimmunerkrankungen) assoziiert. Zu Beginn der Autoantikörperdiagnostik auf kernhaltigen Zellen wurden die vier Grundmuster homogen, zirkulär, gesprenkelt und nukleolär beschrieben. Inzwischen gilt die HEp-2-Zelle (humane Epithelzelle der Linie 2) als allgemein übliches Substrat zur Bestimmung von ANA. Die HEp-2-Zelllinie stammt ursprünglich von einer Epithelzelle ab, welche aus Tumormaterial eines Patienten mit einem Larynxkarzinom gewonnen wurde [5] und zeichnet sich durch einen großen Zellkern und eine rege Zellteilung aus, sodass in den relativ wenigen Zellen auf einem Objektträgerspot alle Phasen des Zellzyklus gefunden werden können. Durch diese Vorteile der HEp-2-Zelle werden heute wesentlich mehr Fluoreszenzmuster unterschieden [6], die zugehörigen klinisch relevanten Antigene sind weitestgehend definiert. Bei genauerer Analyse werden aber auf der HEp-2-Zelle nicht nur Antikörper gegen Zellkernantigene erkannt, sondern auch Antikörper gegen andere zelluläre Bestandteile, wie zum Beispiel Antigene, die nur in der Zellteilung auftreten oder Strukturen, die nur im Zytoplasma vorkommen. In den vergangenen Jahren hat sich der Begriff antinukleäre Antikörper (ANA) eingebürgert. Es besteht heute aber Einigkeit, dass alle auf einer HEp-2-Zelle erkennbaren Muster beschrieben werden sollten, auch wenn sie nicht strikt einem Zellkern-Antikörper entsprechen.

Die österreichische Arbeitsgruppe für Autoimmundiagnostik (EASI; http://www.easi-network.com) hat sich in mehreren Sitzungen dazu entschlossen, die 2014 in englischer Sprache publizierten Empfehlungen [7], an denen auch die deutsche und die österreichische EASI-Gruppe beteiligt waren, auf eine für den deutschen Sprachraum praktikable Version anzupassen. Allgemeine Übereinstimmung war auch gegeben, dass die Musterbeschreibungen in deutscher Sprache erfolgen sollten. Da aber gelegentlich deutsche Bezeichnungen stark von englischen Originalbezeichnungen abweichen, wird im Zweifelsfall in Klammer auch der englische Terminus angegeben, um jenen Ärzten, die in internationaler Literatur nachlesen wollen, die richtige Fährte zu legen.

Im nächsten Schritt wurden die österreichischen EASI-Empfehlungen einem breiten Publikum im Rahmen der Jahrestagung der österreichischen Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie (ÖGLMKC) im November 2014 in Salzburg vorgestellt. Gegen die vereinbarten Änderungen wurden keine Einwände erhoben, die einheitliche deutsche Bezeichnung wurde allgemein positiv aufgenommen.

In einem Treffen mit zwei Vertretern der deutschen EASI-Gruppe sowie der DGKL-Sektion Immundiagnostik (Karsten Conrad, Ulrich Sack) wurde vereinbart, dass die in Österreich getroffenen Empfehlungen in dieser Form mitgeteilt und einem breiten deutschsprachigen Publikum zur Diskussion gestellt werden sollten.

Die internationalen Empfehlungen

Die internationalen Empfehlungen [7], wie Antikörper gegen zelluläre Bestandteile bestimmt werden sollten, wurden tabellarisch in 25 Punkten zusammengefasst. Tabelle 1 gibt die Empfehlungen in deutscher Sprache wieder, wobei leichte Modifikationen nach Meinung der österreichischen EASI-Gruppe vorgenommen wurden.

In Tabelle 2 wurden die Fluoreszenzmuster, die auf der HEp-2-Zelle erkannt werden können, in 4 Rubriken zusammengefasst. Es wird unterschieden zwischen häufig erkannten und weniger häufig erkannten Mustern. Beide Gruppen werden wieder unterteilt in Kern- und zytoplasmatische Muster. Zu den weniger häufigen Mustern zählen auch die Mitosemuster. Die im Original angegebene Unterscheidung in häufig und weniger häufig erkannte Muster wird in der Tabelle beibehalten, auch wenn die Zuordnung nicht immer klar nachvollziehbar ist. Nach einer in mehreren Ländern durchgeführten EASI-Umfrage [8] werden die Zellkern-Muster homogen, gesprenkelt, zentromer und nukleolär von den meisten Laboratorien angegeben. Das zirkuläre Muster oder das Muster viele oder wenig nukleäre Punkte (nuclear dots) werden nach unserer Erfahrung aus österreichischen Ringversuchen meist erkannt. Die Unterscheidung häufig oder weniger häufig erkannte Muster im Rahmen einer Empfehlung symbolisiert aber auch eine gewisse Kompromisslösung, dass ein Labor nicht unbedingt alle Muster erkennen muss. Die Tabelle enthält aber einen Großteil von unterscheidbaren Fluoreszenzmustern, welche auf Autoimmundiagnostik spezialisierte Laboratorien erkennen sollten.

Kommentare zu den internationalen Empfehlungen

Im Folgenden wird auf die Empfehlungen des internationalen Konsenses zur ANA-Bestimmung [7] detailliert eingegangen. Durchgeführte Änderungen und Ergänzungen für den deutschsprachigen Raum werden begründet (s. a. Tabelle 1).

Empfehlung 1: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 2: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 3: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 4: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Zur Verlaufskontrolle einer Erkrankung sind ANA ebenso wie die ANA-Titer nicht geeignet. Zwar gibt es einzelne Erkrankungen, für die eine Änderung eines ANA-Titers im Krankheitsverlauf dokumentiert wurde [9], zur Aktivitätsmessung werden aber üblicherweise schneller reagierende akute Phase-Reaktanten verwendet. Die Änderung des Autoantikörper-Titers ist eher von theoretischem Interesse und weniger von praktischer Bedeutung.

Empfehlung 5: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Alternative Methoden sind in der Regel spezifischer aber weniger sensitiv und erfassen nur Antikörper gegen eine bestimmte Anzahl definierter Antigene. Hingegen werden auf der Zelle auch andere Antigene exprimiert und entsprechende Antikörper erfasst. Das bewirkt zum einen die höhere Sensitivität, zum anderen aber die geringere Spezifität der iIF, da auch nicht krankheitsrelevante Autoantikörper gesehen werden.

Empfehlung 6: Wird dem Original entsprechend übernommen und geringfügig ergänzt.

Alternativ zur iIF angewendete Methoden liefern zwar weitgehend übereinstimmende, aber nicht immer idente Ergebnisse. Es ist daher notwendig, dem Zuweiser mitzuteilen, mit welcher Methode auf ANA getestet wurde. Eine mögliche Methodenangabe beim ANA-Screening auf HEp-2-Zellen wäre zum Beispiel ANA (indir. Immunfluoreszenz). Die genaue Angabe der Analysenmethode ist auch in anderen Bereichen der klinischen Chemie erforderlich. So wurde bereits 1990 das System der sogenannten LOINC (Logical Observation Identifiers Names and Codes) entwickelt (http://loinc.org/). Eine entsprechende Anpassung an bereits vergebene LOINC-Kennzahlen ist in Diskussion.

Empfehlung 7: Wird dem Original entsprechend übernommen und geringfügig ergänzt.

Im Handel ist eine Reihe von alternativen Bestimmungsmethoden zu finden, die als sogenannte ANA-Screens vertrieben werden. Alle diese sogenannten Screening-EIA enthalten eine begrenzte Anzahl von Antigenen und dienen einer selektiven Bestimmung von Autoantikörpern mit bekannter klinischer Bedeutung. Der Name ANA-Screen wird zu Unrecht verwendet, da hier nur auf eine limitierte Anzahl von Autoantikörpern getestet wird. Durch breiten Konsens gestützte Alternativbezeichnungen können derzeit noch nicht vorgeschlagen werden. Bezeichnungen ähnlich „Kollagenose-Screen“ wären eine mögliche Alternative. Die Bezeichnung ANA-Screen sollte auf die Autoantikörpersuche auf HEp-2-Zellen begrenzt bleiben.

Empfehlung 8: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 9: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Mischkonjugate welche Antikörper vom Typ IgG und IgA und IgM erfassen, werden in der indirekten Immunfluoreszenz zum Teil angewendet. In der Diagnostik von ANA ist aber die Bedeutung von Autoantikörpern vom Typ IgM und IgA unklar [3, 4, 10, 11].

Empfehlung 10: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Jedes Labor muss selbst entscheiden, ab welcher Titerhöhe ein Befund als potentiell pathologisch zu werten ist. Eine Titerhöhe von 1:100 wird allgemein als obere Norm akzeptiert. Das Evaluieren eines 95% Vertrauensinterwalls einer gesunden Vergleichspopulation ist theoretisch das richtige Vorgehen, praktisch aber kaum durchführbar. Die Teilnahme an nationalen und internationalen Ringversuchen erscheint uns eher als praktikabler Weg, die Richtigkeit der eigenen Analytik zu überprüfen und den Grenzwert zwischen normal und pathologisch erhöht zu definieren.

Empfehlung 11: Die Empfehlung kann nur mit Ergänzung akzeptiert werden.

Ein Titrieren bis zur höchsten positiven Verdünnungsstufe war früher üblich. Die Erfahrung hat aber gezeigt, dass es keine verwertbare Befunderweiterung bringt, wenn eine Probe bis zur letzten erkennbaren Titerstufe verdünnt wird. Angepasst an die in Österreich in vielen Laboratorien übliche Routine wurde der Kompromiss dahingehend geschlossen, dass wir eine Verdünnung bis zu einer Titerstufe von 1:2560 als ausreichend empfinden. Auch eine niedrigere Titerstufe kann als Endtiter akzeptiert werden. Wesentlich ist die Unterscheidung, ob der Autoantikörper positiv oder stark positiv ist. Wir erachten einen Nachweis bei der Verdünnung von größer als 1:640 für einen hochpositiven Autoantikörperbefund.

Empfehlung 12: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Allerdings gibt es noch keine ausreichenden Beschreibungen in Bezug auf definierte Fluoreszenzmuster. Der bisher vorliegende Konsens wird in Tabelle 2 zusammengefasst und im nachfolgenden Absatz diskutiert. Wir möchten aber darauf hinweisen, dass derzeit ein neuerlicher internationaler Arbeitskreis das Thema Fluoreszenzmuster bearbeitet hat und das Ergebnis zur Publikation vorbereitet wird.

Empfehlung 13: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 14: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Falls dem Labor die klinische Verdachtsdiagnose eines SLE bekannt ist, kann die ergänzende Untersuchung auf dsDNA-Antikörper sinnvoll sein, weil dsDNA-Antikörper in der Zuordnung der Symptome ein ergänzendes Kriterium für SLE bilden [2, 12, 13]. Aus analytischer Sicht passt zum dsDNA-Antikörper ein homogenes Muster in der iIF. Inwieweit bei positiven aber nicht homogenem ANA-iIF ein positiver dsDNA-Antikörperbefund im ELISA von Bedeutung ist, kann derzeit nicht eindeutig beantwortet werden [10, 14]. Jedoch sind im ELISA positive dsDNA-Antikörper bei nicht passendem iIF-Befund in der Regel nicht mit SLE assoziiert, sondern bei anderen Erkrankungen (z.B. multipler Sklerose) zu finden.

Empfehlung 15: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Allerdings wurde der FARR-Assay herausgenommen, da dieser in Österreich nicht mehr verwendet wird. Für Deutschland besteht hier noch Diskussionsbedarf, da an der Überlegenheit bezüglich SLE-Diagnostik gegenüber den ELISAs kein Zweifel besteht. Der FARR-Assay sollte daher zumindest in spezialisierten Autoimmunlaboren als ergänzende Methode eingesetzt werden.

Empfehlung 16: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 17: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 18: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 19: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 20: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 21: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlung 22: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Ein hochtitrig und als einziger Autoantikörper vorliegender U1nRNP-Antikörper [15] ist das serologische Zeichen der Mischkollagenose (mixed connective tissue disease, MCTD; Sharp-Syndrom). Es darf aber nicht außer Acht gelassen werden, dass neben dem Sharp-Syndrom weitere Mischkollagenosen existieren, welche eine andere Autoantikörper-Analytik (z.B. Bestimmung von Ku- oder PM-Scl-Antikörper) erfordern.

Empfehlung 23: Wird dem Original entsprechend übernommen.

Empfehlungen 24 und 25: Werden wegen fehlender Durchführbarkeit im Routinelabor gestrichen (sollten aber für immunologische Speziallabors gültig sein).

Diese abschließenden Empfehlungen sind verständlich und es ist nachvollziehbar, dass sie in einer allgemein gültigen Richtlinie angeführt werden. Im Rahmen der üblichen Laborarbeit sind diese Empfehlungen aber kaum umzusetzen. Auch in der Originalarbeit wurde darauf hingewiesen, dass sich die beiden Expertengruppen IUIS und EASI in der Zustimmung zu diesen Empfehlungen signifikant unterschieden.

Wir haben in einer eigenen, den Empfehlungen entsprechenden Untersuchung den bei uns gültigen Normwert des ANA-Titers überprüft [16]. Seit der grundlegenden Arbeit von Eng Tan und Mitarbeiter 1997 [17] gilt eine Probenverdünnung von 1:100 als der optimale Grenzwert, um Patienten mit SLE von gesunden Vergleichspersonen zu unterscheiden. Dieser Grenzwert wurde allgemein akzeptiert und gilt seither als die obere Normgrenze des ANA-Titers im serologischen Screening bei Verdacht auf eine Autoimmunerkrankung. Wir haben diesen Grenzwert mit Seren von bekannten SLE-Patienten im Vergleich zu Gruppen von Patienten mit nichtentzündlich rheumatischen Erkrankungen sowie einer Gruppe von gesunden Blutspendern überprüft. Obwohl wir im Vergleich zu den Untersuchungen von 1997 vermutlich bessere HEp-2-Zellen, ein anderes Konjugat und mit Sicherheit ein lichtstärkeres Fluoreszenzmikroskop verwenden, kommen wir zum gleichen Ergebnis. Es ist anzunehmen, dass die kommerziell erhältlichen Reagenzien durchwegs darauf abgestimmt sind, dass in den meisten Laboratorien die Serumverdünnung von 1:100 als pathologischer Grenzwerttiter angesehen werden kann. Die Überprüfung des Kontrollwertes für jedes Labor und das Errechnen einer 95% Vertrauensgrenze ist praktisch kaum möglich, da sowohl die Patientengruppen als auch die Kontrollgruppen klar definiert sein müssen. Personen, die das Blut für eine solche Studie zur Verfügung stellen, müssen auch mit der zusätzlichen Analyse einverstanden sein und die genaue Diagnose muss bekannt sein. Diese Voraussetzungen sind nur in den wenigsten Laboratorien gegeben. Unsere Untersuchung wurde in einem Schwerpunktkrankenhaus durchgeführt, in dem die zuständigen Ärzte auch im Autoimmunlabor mitarbeiten und daher Zugang zu Patienten hatten. Dennoch war das Sammeln von geeigneten Studienpatienten mühselig und langwierig. Aus unserer eigenen Erfahrung sind wir überzeugt, dass kaum ein Labor in der Lage ist, eine eigene Normwertstudie durchzuführen. Aufgrund der Nichtpraktikabilität wollen wir daher die Punkte 24 und 25 nicht empfehlen. Wir glauben vielmehr, dass das einzig praktikable System zur Prüfung der Titerstufen und der richtigen Einschätzung der Höhe eines positiven Befundes die Beteiligung an entsprechenden Ringversuchen ist.

Kommentare zu den Musterbeschreibungen

Das Immunfluoreszenzmuster auf der HEp-2-Zelle spiegelt die topographische Verteilung der Zielantigene wider und gibt Hinweis auf die zu Grunde liegende Autoantikörper-Spezifität. Die hohe Teilungsrate der HEp-2-Zelle und das Vorliegen aller Phasen eines Zellzyklus sind die Voraussetzung, dass die Antikörper gegen unterschiedliche Bestandteile der Zelle binden können und entsprechende Fluoreszenzmuster bewirken. In der ruhenden Zelle sind neben den antinukleären Antikörpern (ANA) auch Muster von antizytoplasmatischen Antikörpern erkennbar. Während den Teilungsphasen werden andere zelluläre Bestandteile gebildet und damit Autoantikörper gegen mitoseassoziierte Antigene in der iIF sichtbar. Für die Summe der Antikörper, die in der iIF auf HEp-2-Zellen erkannt und mit der Anforderung ANA-Test bestimmt werden, wäre die Bezeichnung antizelluläre Antikörper richtig. Unter Rücksichtnahme auf Abrechnungsmodalitäten in den Ländern weltweit ist ein Namenswechsel von ANA auf eine andere Bezeichnung kurzfristig nicht möglich. Es besteht daher Einigkeit, dass der Begriff ANA beibehalten wird, mit der Testanforderung aber alle Muster, die auf der HEp-2-Zelle erkennbar sind, angegeben werden sollen, auch wenn das Muster nicht einem Antikörper gegen Zellkernantigene entspricht.

Tabelle 2 gibt neben den in der Originaltabelle angeführten Musterbeschreibungen unsere vorgeschlagene deutsche Bezeichnung an. Dazu wurden in der Tabelle die dazugehörigen Antigene und die mit diesem Muster und Antikörper am häufigsten in Verbindung stehenden Erkrankungen aus dem Originaltext übernommen und zum Teil ergänzt [7]. In einzelnen Musterbeschreibungen, in denen der deutsche Ausdruck nicht sicher dem englischen Originalausdruck zugeordnet werden kann, wurde der englische Begriff in Klammer beigefügt. Im Unterschied zur Originaltabelle wurden noch einige wenige Muster ergänzt (so fehlen beispielsweise Mitose-Muster im Originaltext oder wurden fälschlicherweise den Kernmustern zugeordnet), die zwar nicht zwangsläufig von jedem erkannt werden müssen, die aber dem erfahrenen Befunder bekannt sind. Die Tabelle 2 stellt eine derzeit empfohlene Musterbeschreibung dar. In einem neuerlichen Konsensusmeeting im August 2014 in Brasilien wurde versucht, die Musterbeschreibungen eindeutig zu formulieren und Hinweise für die Musterdefinitionen zu geben. Die Zusammenfassung dieses Konsenses ist in Arbeit.

Diskussion

Die Autoantikörperdiagnostik hat sich in den letzten Jahrzehnten eindrucksvoll weiterentwickelt, wenngleich die Grundmethode der indirekten Immunfluoreszenz beibehalten wurde. Auf den ursprünglich verwendeten Organschnitten mit ruhenden kernhaltigen Zellen wurden vier Grundmuster beschrieben. Mit der Einführung der sich schnell teilenden HEp-2-Zelle als Substrat wurden zunehmend mehr Muster und dazugehörige Autoantikörper beschrieben. Der Befund, der mit der HEp-2-Zelle als Substrat erhoben wird, ist mit der Bezeichnung ANA sachlich nicht richtig angegeben. Es sollten neben den typischen, nur gegen Antigene des Zellkerns gerichtete Antikörper (= ANA), auch Muster von Antikörpern beschrieben werden, die gegen andere Zellkompartimente (z.B. bestimmte Organellen) gerichtet sind wie Strukturen des Zytoplasmas, der Kernmembran oder der sich teilenden Zelle. Solche Antikörper können bei Erkrankungen wie autoimmunen Myopathien, der primär biliären Leberzirrhose oder dem SLE diagnostische Bedeutung haben.

In einem zertifizierten Labor können Empfehlungen, die durch international anerkannte Expertengruppen herausgegeben werden, nicht ignoriert werden. Die österreichische EASI-Gruppe hat sich daher bemüht, die 2014 veröffentlichten Empfehlungen an österreichische Verhältnisse anzupassen. Aus Zeitgründen war eine Abstimmung mit der deutschen EASI-Gruppe sowie der DGKL-Sektion Immundiagnostik bisher nicht möglich. Wir möchten ausdrücklich betonen, dass die vorliegenden Überlegungen und Korrekturen zur Antikörperdiagnostik auf HEp-2-Zellen eine vorläufige Stellungnahme darstellt als Grundlage für eine breite Diskussion, um auch für den deutschen Sprachraum einen gültigen Konsens zu finden.

Internationale Empfehlungen werden in der englischen Sprache herausgegeben, Übersetzungen und klare Empfehlungen in andere Sprachen fehlen. Die Folge sind zumeist unterschiedliche Ausdrucksweisen für die Musterbeschreibungen. In Österreich werden häufig deutsche und englische Bezeichnungen vermischt, vor allem dann, wenn für den englischen Ausdruck kein eindeutiges und allgemein benütztes Eigenschaftswort greifbar ist. Die österreichische EASI-Gruppe hat sich bemüht, eine deutsche Formulierung zu finden, um eine landesweit einheitliche Befundausgabe zu erleichtern.

Neben sprachlichen Formulierungen sind noch andere Probleme zu berücksichtigen. In Tabelle 2 werden viele Muster angegeben, die von erfahrenen Befundern erkannt werden können. Das soll aber nicht bedeuten, dass ein Routinelabor auch alle Muster erkennen muss. Wichtig ist das Urteil, ob ein Autoantikörper in krankheitsrelevanter Konzentration vorliegt oder nicht. Darauf beruht auch das Prinzip von automatischen Lesegeräten für iIF, mit denen in erster Linie negative Proben richtig erkannt werden sollten, um Zeit und überflüssige Analytik einzusparen [18]. Für den interessierten Befunder und Befundempfänger dürfte die Tabelle 2 aber eine nützliche Hilfe darstellen.

Ein weiteres Problem für eine genaue Befundausgabe ergibt sich durch die Verwendung von unterschiedlichen Computersystemen und verwendeten Softwareprogrammen für die Befundausgabe. Die Anzahl der Zeichen, die für einen Befund zur Verfügung stehen, ist meist limitiert und es ist schwierig, neben dem Muster und der verwendeten Methode auch noch den englischen Ausdruck anzugeben. Dieses Problem muss ein Labor für sich selbst entscheiden und Wege suchen, um den Empfehlungen so weit wie möglich nachkommen zu können.

Zusammenfassend kann die Umsetzung internationaler und nationaler Empfehlungen von Expertengremien wesentlich zur Harmonisierung der Autoimmundiagnostik beitragen, ersetzt aber nicht die enge Kooperation zwischen Labor und einsendendem Arzt im Rahmen der Befundermittlung und Befundinterpretation.