Aussagekraft von Prokollagen Typ I aminoterminales Propeptid (P1NP) als Knochenaufbaumarker

Kollagene stellen aufgrund ihrer strukturgebenden Funktion in Basalmembranen, Haut, Sehnen, Bändern, Knorpel und Knochen eines der bedeutendsten Proteine des menschlichen Organismus dar [1, 2, 5, 21]. Das gemeinsame Strukturmerkmal der über 20 verschiedenen bisher identifizierten Kollagene ist ihre tripelhelikale Konformation, bei der jeder linksgängige Helix eine rechtsgängige Superhelix ausbildet. Voraussetzung für diese Anordnung ist die Zusammensetzung der einzelnen Helix aus repetitiven Aminosäuresequenzen der Form Gly-X‑Y, wobei an der X‑ und Y‑ Position bevorzugt Prolin sowie Hydroxyprolin/Hydroxylysin auftreten [17, 21].

Die Kollagensynthese beginnt im Intrazellulärraum am rauen endoplasmatischen Retikulum der Fibroblasten und Osteoblasten mit der Bildung von Kollagenhelices, die als Alpha-1- bzw. Alpha-2-Prokollagene bezeichnet werden [35, 37, 38, 44]. Sie sind durch sog. Propeptide gekennzeichnet, die sich sowohl am N‑terminalen sowie am C‑terminalen Ende des Prokollagens befinden und deren Abspaltung wichtig für die spätere Zusammenlagerung der Kollagentripelhelix ist [22, 24‐26, 28, 33, 37, 38]. Anschließend kommt es zur Hydroxylierung von etwa 50 % der Prolin- und 10–80 % der Lysinreste.

An die Hydroxylierung schließt sich die Glykosylierung der Hydroxylreste mit Glukose und Galaktose an, bevor durch die Zusammenlagerung dreier Kollagenhelices die gewünschte Tripelhelix entsteht. Diese wird durch Disulfidbrücken am N‑ und C‑terminalen Ende stabilisiert und zur Weiterverarbeitung in den Extrazellulärraum sezerniert [28, 33, 37, 38]. Nach der Sekretion folgt die Entfernung der Propeptide durch Amino- und Carboxypropeptidasen sowie die Zusammenlagerung von 5 Tripelhelices zu 10– 100 nm dicken Mikrofibrillen, die zu 3–5 µm dicken Fibrillen aggregieren. Die Desaminierung von Lysylresten durch eine Lysyloxidase führt zur Entstehung von Aldehydgruppen, die mit Aminogruppen anderer Lysylreste Schiffsche Basen bilden und so die Kollagenhelices irreversibel miteinander vernetzen [40‐42].

Im Folgenden soll auf Kollagen Typ I eingegangen werden, das als Trimer (aus zwei identischen Alpha-1-Ketten [je 138 Aminosäuren]) und einer sich in Größe, Aminosäuresequenz und Antigenität unterscheidenden Alpha-2-Kette (55 Aminosäuren; [42, 43]) über 90 % der organischen Knochenmatrix darstellt.

P1NP wird von Fibroblasten und Osteoblasten als prolin- und hydroxyprolinreiche Vorstufe des Typ-1-Kollagens synthetisiert. Es ist damit ein Marker der frühen Knochenneubildung, insbesondere der Osteoblastenproliferation [30, 31, 33]. Weitere Knochenformationsmarker sind z. B. das parallel zu P1NP gebildete Prokollagen Typ 1 Carboxyterminales Propeptid (P1CP), die knochenspezifische alkalische Phosphatase, die im Zusammenhang mit der Reifung der Knochenmatrix gebildet wird sowie Osteocalcin als Indikator für die späte Phase der Knochenbildung. Osteocalcin wird im Verlauf der Knochenmineralisation synthetisiert [33, 36‐38].

Das P1NP wurde ursprünglich als sog. fetales Antigen 2 (FA2) aus Amnionflüssigkeit isoliert, die im Verlauf des zweiten Trimenons gewonnen wurde [48, 51, 52]. Aufgrund der Verteilung des FA2 zwischen kindlichen und maternalen Gewebekompartimenten ist davon auszugehen, dass es sich um ein rein fetales Protein handelte. Zunehmend konnte aber beispielsweise eine vermehrte Synthese von FA2 im Granulationsgewebe der Wundheilungsreaktion festgestellt werden, und es wurde eine Produktion von FA2 in Fibroblasten und Osteoblasten beobachtet [46, 47].

Darüber hinaus ist eine verstärkte Ablagerung des fetalen Proteins im reaktiv proliferierenden Stromagewebe im Umfeld maligner Tumoren, z. B. bei Brustkrebs, feststellbar [33, 49]. Bei der Analyse der Aminosäuresequenz von FA2 stellte sich heraus, dass dieses Protein dem aminoterminalen Propeptid des Kollagens Typ 1 entsprach. Charakteristisches Merkmal von Prokollagen Typ 1 sind seine globulären, trimeren Erweiterungen am C‑ und N‑ terminalen Ende des Moleküls, die nach der Sekretion des Prokollagens in den Extrazellulärraum durch spezielle Propeptidasen abgespalten werden [33, 52, 53]. Es werden als stöchiometrisch zur Kollagenbildung äquivalente Mengen an P1CP und P1NP in die Zirkulation freigesetzt, so dass diese beiden Marker zur diagnostischen Bestimmung der Kollagensynthese verwendet werden können. Die normalen Serumspiegel von P1NP liegen u. a. für prämenopausale Frauen bei ca. 30,1 ng/ml, für postmenopausale Frauen bei 37,1 ng/ml und für Männer im Alter zwischen 51 und 70 Jahren bei ca. 36,4 ng/ml [45].

Obwohl Typ-1-Kollagen auch noch in anderen Strukturen vorkommt, wie Haut, Sehnen und Dentin, ist der Kollagenmetabolismus in diesen Geweben zu gering, um einen messbaren Einfluss auf die Mengen von P1CP und P1NP im Serum zu nehmen [33, 49].

P1CP und P1NP besitzen unterschiedliche Wege der Elimination aus der Zirkulation. P1CP, ein globuläres Glykoprotein, hat ein Molekulargewicht von 115 kDa und wird über Mannose-Rezeptoren in Endothelzellen in der Leber aufgenommen und dort verstoffwechselt. P1NP, ein phosphoryliertes, teils globuläres, teils helikales Protein, hat dagegen nur ein Molekulargewicht von 70 kDa und wird über den Scavenger-Rezeptor in die Endothelzellen der Leber aufgenommen [33‐35]. Während der Scavenger-Rezeptor von hormonellen Einflüssen unabhängig ist, wird der Mannose-Rezeptor in seiner Funktion von verschiedenen Hormonen reguliert. Für Calcitriol, Dexamethason, Prostaglandin E und Thyroxin konnten Änderungen in der P1CP-Clearance nachgewiesen werden [54]. So fördert z. B. eine Hyperthyreose eine erhöhte Clearance von P1CP, bei einer Schilddrüsenunterfunktion sinkt die Clearance [33, 58, 60‐62].

P1NP ist ein thermisch instabiles Peptid, das bei Inkubation mit 37 °C in eine hochmolekulare und niedermolekulare Form zerfällt, die aber immunologisch identisch sind. Die verschiedenen bekannten Nachweisverfahren unterscheiden sich in ihrer Spezifität für diese beiden Varianten. Die Kenntnis der jeweiligen Experimentbesonderheiten ist Voraussetzung für die Auswahl der optimalen Bestimmungsverfahren für P1NP im Rahmen der Diagnostik [33, 60, 61]. Die Bestimmung erfolgt heutzutage üblicherweise mit vollautomatisierten Immunoassays, z. B. der Firma Roche mittels Elektrochemilumineszenz.

In chromatographischen Verfahren können unter Verwendung von Antikörpern gegen Alpha-1-Ketten des P1NP beide Formen als zwei klare Peaks identifiziert werden. Mit Hilfe einer Absorptionsmessung bei 280 nm treten die zwei molekularen Erscheinungsformen als Fraktionen 22 und 27 auf. Werden in einem weiterführenden Experiment die beiden Fraktionen bei 37 °C inkubiert, so resultieren unterschiedliche Ergebnisse: Während es in der Fraktion 22 zu einer Abnahme der hochmolekularen zugunsten der niedermolekularen Verbindung kommt, ergeben sich für die Fraktion 27 keine wesentlichen Veränderungen [6, 23, 25, 27, 50]. Dies bestätigt die Vermutung, dass P1NP ein heterogenes Erscheinungsbild aufweist und die hochmolekulare, trimere Struktur des P1NP als thermisch instabile Verbindung bei Körpertemperatur in die niedermolokulare, monomere Alpha-1-Kette zerfällt. Begründen lässt sich diese Eigenschaft mit dem biochemischen Aufbau des P1NP. Als Kollagenvorläufer besitzt das trimere P1NP einen geringen Anteil an tripelhelicalen Abschnitten. Da aber die Tripelhelix des Kollagens nur durch schwache, nichtkovalente Bindungen zwischen den einzelnen Helices stabilisiert wird, enthält das trimere P1NP wenig widerstandsfähige Verbindungen und ist damit temperaturempfindlich [33, 55, 56].

In der SDS-Gelelektrophorese dagegen zeigen sich keine Unterschiede in den Eigenschaften der hoch- und niedermolekularen Form des P1NP. Fraktion 22 und Fraktion 27 weisen beide ein identisches Molekulargewicht von 27 kDa auf. Dieses Verhalten impliziert, dass sowohl das Trimer als auch das Monomer aus intakten Alpha-1-Ketten bestehen, die ihrerseits das Molekulargewicht bestimmen. Die Gewichtsdifferenz der einzelnen Alpha-1-Ketten (14,213 kDa) zu den in der SDS-Gelelektrophorese gemessenen 27 kDa erklärt sich durch das variable Vorkommen von 6 bis 9 Hydroxyprolinresten am C‑terminalen Ende der Alpha-1-Ketten [58, 59, 63‐65].

Um den Gehalt von P1NP in Patientenproben zu bestimmen, gibt es noch zwei weitere Testverfahren. Unter Verwendung von iodiertem (₁₂₅I) P1NP kann die hochmolekulare Struktur mit einem Radioimmunoassay (RIA) detektiert werden, während dieser Test sich nicht zum Nachweis des niedermolekularen Monomers eignet. Mögliche Ursache ist eine unterschiedliche Affinität der Antikörper zu der hoch- und niedermolekularen Form des P1NP. Durch einen speziellen Sandwich-ELISA mit monoklonalen Kaninchenantikörpern und Biotin-markierten Antikörpern gelingt die Darstellung beider Varianten. Wird im Versuch P1NP aus Amnionflüssigkeit über mehrere Stunden bei 37 °C inkubiert, so zeigen sich im ELISA keine Konzentrationsunterschiede, während im RIA die P1NP-Konzentration drastisch sinkt. Grund hierfür ist die Umwandlung der trimeren in die monomere Form, die – wie oben bereits erwähnt – mit dem RIA nicht mehr nachzuweisen ist. Bei einer Inkubationszeit von über 72 h ist ein P1NP-Nachweis aufgrund einer Halbwertszeit der trimeren Form von ca. 10 h im RIA nicht mehr möglich. Normwerte für die gemessenen Konzentrationen von P1NP betragen für den ELISA-Test 61 µg/l, für den RIA 45 µg/l [50, 56, 57].

P1NP zeigt dabei im Vergleich zu P1CP stärkere Konzentrationsänderungen, was vermutlich mit den unterschiedlichen Clearanceverfahren zusammenhängt. Der hormonsensible Mannose-Rezeptor könnte durch von Tumorzellen sezernierte Wachstumshormone in seiner Aktivität moduliert werden und auf diese Weise die Elimination von P1CP aus dem Serum beschleunigen [3, 4, 20]. Während sich für P1NP somit eine enge Korrelation zwischen Serumkonzentration einerseits und Tumorgröße, Malignität sowie Überlebensdauer des Patienten andererseits manifestiert, ist insgesamt betrachtet aber die Sensitivität der Formationsmarker geringer als die der Resorptionsmarker (Sensitivität: carboxyterminales Typ-I-Kollagen-Telopeptid (CTX): 56 %, P1CP: 24 %, P1NP 30 %), da die osteolytischen Umbauprozesse bei Brustkrebsmetastasen überwiegen [33, 63‐65].

Während die Marker der Knochenresorption somit am sensitivsten für die osteolytischen Knochenmetastasen bei Brustkrebs sind, sind bei Prostatakarzinomen erhöhte Resorptions- und Formationsmarker zu finden, wobei die Marker der Knochenbildung höhere Konzentrationen aufweisen [8, 9, 12, 13]. Die schmerzhaften osteosklerotischen Knochenmetastasen bei Prostatakarzinomen, die bei über 95 % der Patienten mit metastatischem Krankheitsverlauf beobachtet werden, entstehen auf Grundlage einer gesteigerten Aktivität der Osteoblasten, der eine erhöhte Knochenresorption durch Osteoklasten vorausgeht. So kommt es trotz fehlender osteolytischer Läsionen einerseits zu den beobachteten erhöhten CTX-Konzentrationen (Hinweis auf gesteigerten Knochenabbau), andererseits lassen sich auch zunehmende Konzentrationen von Formationsmarkern, wie der alkalischen Phosphatase, P1CP und P1NP, nachweisen [16, 22, 54, 56, 57]. Bei Vorliegen einer benignen Prostatahyperplasie oder eines Prostatakarzinoms ohne nachweisbare Knochenmetastasen zeigen die Marker dagegen keine Veränderungen, was ihre Spezifität in der Diagnostik von Metastasen unterstreicht. Besonders P1NP scheint eng mit dem Auftreten von Knochenmetastasen bei Prostatakarzinomen zu korrelieren, und es ist dabei sensitiver als die übrigen Formationsmarker. Um die Folgen, die eine Metastasierung von Tumorzellen in den Knochen verursachen, zu minimieren oder gar zu verhindern, ist eine rechtzeitige Diagnostik unerlässlich [18, 19]. Vom klinischen Standpunkt aus gesehen, können Metastasierungen in den Knochen in 3 Phasen eingeteilt werden. Die erste Phase beinhaltet das Wachstum der Tumorzellen und deren Ausbreitung, die zweite Knochenschmerzen und die dritte Phase das Auftreten von Frakturen. Um diesen Prozess zu verlangsamen bzw. zu unterbrechen, ist eine gezielte Detektion und frühzeitige Therapie notwendig [8, 9, 33, 65]. Der Nachweis sollte unter optimalen Bedingungen bereits kleinste Metastasen, Mikrometastasen von Tumorzellen im Knochen aufzeigen. Unterstützend zur bildgebenden, apparativen Diagnostik werden hier die Knochenmarker und ihre biochemischen Nachweisverfahren angewandt.

Mit der Bestimmung von Knochenmarkern aus dem Blut kann die Aktivität des Knochenstoffwechsels schnell, einfach und kostengünstig ermittelt werden. Hierzu werden insbesondere die Typ-1-Kollagen-Fragmente, die bei der Knochenformation und -resorption frei werden, bestimmt [12, 13, 33].

Die Aussagekraft für P1NP ist bei Tumorerkrankungen gegeben. Wichtig ist bei der Nachsorge der Tumorpatienten, in regelmäßigen Abständen P1NP zu bestimmen, um den Stoffwechsel der Knochen zu berücksichtigen. Ein Beispiel hierfür ist die Metastasierung postoperativ bei einem Prostatakarzinom bzw. Mammakarzinom. Aufgrund der Serumwerte von P1NP kann der Knochenstoffwechsel des Patienten beurteilt werden, um zukünftige Metastasenentwicklungen zu verhindern. Bei einer Osteoporose und gleichzeitiger Tumorerkrankung wird der Knochenresorptionszustand beurteilt.

Unter folgenden Bedingungen ist die Indikation für die P1NP-Bestimmung gegeben:

Werden die unterschiedlichsten Aspekte der arbeitsmedizinischen Vorsorge, wie sie aktuell im Zentralblatt für Arbeitsmedizin publiziert und diskutiert werden, betrachtet, so wird klar, dass P1NP-Bestimmungen keine Berechtigung im Rahmen von IGeL-Leistungen bzw. Managerchecks im Kontext der Arbeitswelt haben, wohl aber im Bereich der Onkologie als Prognosemarker für die Bildung von Metastasen.

Zukünftige Studien im Bereich der Knochenmarker sollten sich beispielsweise mittels biochemischer [8, 9], funktioneller [10, 11, 14, 39] oder molekularbiologischer [22, 50] Methoden mit weiteren Aspekten beschäftigen.