Next-Generation-Sequencing (NGS)

NGS

next generation sequencing; NGS

Unter dem Begriff Next-Generation-Sequencing (NGS) werden die verschiedenen Techniken der sog. massiven Parallelsequenzierung zusammengefasst, die es erlauben, in einem Pool von DNA-Fragmenten tausende von Molekülen individuell zu analysieren.

Die Techniken zur massiven Parallelsequenzierung wurden als Folge der Entschlüsselung des Humangenoms als Hochdurchsatztechnologien („high-throughput technologies“) entwickelt, um schnell und relativ kostengünstig große DNA-Mengen zu sequenzieren. Die derzeit am häufigsten eingesetzten Techniken im Routinelabor sind die Illumina-Methode mit den Geräten MiSeq, NextSeq und HiSeq sowie die IonTorrent-Methode mit den Geräten Personal Genome Machine (PGM), Proton und S5.

Beiden Methoden gemeinsam ist, dass im Gegensatz zur klassischen Sanger-Sequenzierung, bei der pro Probe die Sequenzanalysen aller Moleküle zu einer repräsentativen Sequenz verschmolzen werden, nun die Analysen aller Einzelmoleküle auch individuell dargestellt und analysiert werden. Dies ermöglicht nicht nur die zeitgleiche Sequenzanalyse der unterschiedlichsten Gene oder DNA-Abschnitte eines Individuums, sondern auch die Verbesserung der Sequenziertiefe („sequencing depth“, „ultra-deep sequencing“), um, statistisch abgesichert, z. B. im Rahmen der Tumoranalysen, Mutationen in diagnostisch oder therapeutisch relevanten Genen im unteren Prozentbereich nachweisen zu können.

Der bei einem NGS-Lauf relevante Parameter ist die Sequenzier-Coverage. Die Coverage beschreibt die Anzahl der einzelnen Reads, also der Sequenzen, die mit einer definierten Referenzsequenz übereinstimmen („alignment“). Aufgrund einer gewissen Fehleranfälligkeit steigt die diagnostische Sicherheit der Analyse mit der Coverage. So wird empfohlen, dass bei der Mutationssuche in Mendel‘schen Erbgängen eine Coverage von 30–50 erreicht werden sollte, um bei 50 %iger Wahrscheinlichkeit eine heterozygote Mutation auch sicher darstellen zu können. Anders sieht es bei einer NGS-Analyse von Tumormaterial aus. Um Mutationen im niedrigen Prozentbereich nachweisen zu können, kalkuliert man hier mit einer Coverage von >500–1000. Die Gesamtzahl der Reads ist dabei abhängig von der durchschnittlichen Länge der Reads und der Länge der Zielsequenz bzw. des Genoms und kann daher durchaus mehrere Millionen Reads betragen. Entsprechend dieser Anzahl an Reads und der parallel zu analysierenden Proben tätigt man auch die Auswahl der NGS-Geräte. Mit den Anforderungen an Coverage, Anzahl und Länge der Reads und Anzahl der Proben steigt meist auch der zeitliche Aufwand für die Analyse und kann durchaus mehrere Tage in Anspruch nehmen. Auch werden aus wirtschaftlichen Überlegungen zur Kostenreduzierung gern mehrere Proben gemeinsam abgearbeitet. Diese Variablen bestimmen u. a. die Strategie in der NGS-Diagnostik.

Für eine gezielte Routinediagnostik werden derzeit bevorzugt Gen-Panels eingesetzt, die eine definierte Anzahl und meist die differenzialdiagnostisch zu einem Krankheitsbild infrage kommenden Gene enthalten und meist eine höhere Sensitivität haben.

Eine weiterführende und umfassendere Diagnostik erlauben u. a. klinische Exom-Panels, bei denen die Exome der bei OMIM gelisteten Krankheitsbilder mit über 3000 Genen enthalten sind, eine Whole-Exom-Sequencing-(WES-)Analyse oder eine Whole-Genome-Sequencing-(WGS-)Analyse. Mit größerer Komplexität steigen die Anforderungen an die Bioinformatik und Serverkapazitäten, um diese Datenmengen sicher auszuwerten.