Doppelblotting
Doppelblotting
Englischer Begriff
double blotting
Definition
Blottransfer von Antigenen aus komplexen Proben mit nachfolgendem Blottransfer der Primärantikörper auf eine zweite Membran zur Verhinderung unspezifischer Reaktionen mit Sekundärantikörpern.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Erst wird eine isoelektrische Fokussierung unter denaturierenden Bedingungen oder eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese durchgeführt. Darauf folgt der Transfer der Proteine auf eine Blotmembran entweder durch Elektro- oder Pressblotting, die Blockierung der unbesetzten Bindungsstellen und Inkubation mit einem Antikörper, z. B. gegen humanes Erythropoietin. Nachdem die Membran kurz in einen sauren Stripping-Puffer (25 M Glycin-HCl pH 2 mit 1 % Tween 20 und 1 % SDS) getaucht wurde, legt man sie auf eine zweite Blotmembran und führt einen Elektrotransfer in Richtung Kathode durch. Auf diese Weise werden die Primärantikörper wieder von den Antigenen desorbiert und wandern zu der zweiten Blotmembran. Die Antigene und die störenden Proteine bleiben auf der ersten Membran haften. Die zweite Membran wird blockiert und mit den Sekundärantikörpern inkubiert. Die Detektion erfolgt meistens mit über Chemilumineszenz.
Einsatzgebiet
Antidoping-Kontrolle im Humanurin: Wenn beim Western Blotting sehr komplexer Proben, wie z. B. Humanurin, sehr starke unspezifische Wechselwirkungen von Sekundärantikörpern mit einigen Probenproteinen, z. B. Urinproteinen, auftreten, wird ein zweiter Transferschritt durchgeführt.
Untersuchungsmaterial
Meist Humanurin.
Instrumentalisierung
Ausrüstung für isoelektrische Fokussierung im Polyacrylamidgel bestehend aus Horizontal- oder Minivertikalkammer, Stromversorger, Umlaufthermostat und Blotting-Apparatur (entweder für Elektrotransfer oder für Pressblotting); Chemilumineszenz-CCD-Kamerasystem.
Spezifizität
Sehr hoch, weil Sekundärreaktionen von Begleitproteinen ausgeschalten werden.
Sensitivität
Je nach verwendetem Chemilumineszenzsubstrat im niedrigen Picogramm- bis hohen Femtogrammbereich.
Fehlermöglichkeit
Fehler bei der Elektrophorese können bei Verwendung von Fertiggelen minimiert werden. Für den Elektrotransfer bei Western Blotting können fertige Pufferkits eingesetzt werden.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Relativ aufwendige mehrschrittige Methode.
Bewertung – Methodenhierarchie (allg.)
Doppelblotting ist eine Methode für biochemisch arbeitende Labors.
Literatur
Lasne F (2001) Double-blotting: a solution to the problem of non-specific binding of secondary antibodies in immunoblotting procedures. J Immunol Methods 253:125–131CrossRef