Elektroelution

electroelution

Rückgewinnung von Proteinfraktionen aus Polyacrylamidgelen mittels elektrischem Feld.

Um Proteinfraktionen quantitativ aus einem Polyacrylamidgel zu eluieren, benötigt man ein elektrophoretisches Verfahren. Wenn man Ammoniumkarbonat-Puffer verwendet, entweichen die Puffermoleküle später beim Lyophilisieren in die Gasphase. Es gibt mehrere unterschiedliche Konzepte:

Methode 1: Beim einfachsten Prinzip, gezeigt in Abb. 1A, wird das ausgeschnittene Gelstückchen, das die gewünschte Proteinfraktion enthält, in ein Glasröhrchen auf eine Fritte appliziert. Das Ende des Röhrchens ist mit einer Dialysiermembran verschlossen. Man setzt das Röhrchen in eine Vertikalelektrophoreseapparatur ein, die meist für mehrere parallele Elektroelutionen geeignet ist. Das Protein wandert elektrophoretisch bis zur Dialysemembran, die für die großen Moleküle unpassierbar ist. Von dort kann das reine Protein entnommen werden.

Methode 2: Wie in Abb. 1B gezeigt ist, funktioniert die zweite Methode ohne Membran. Hierbei wird ein Elutionsgefäß in ein Standardreaktionsgefäß (Typ Eppendorf-Gefäß) mit 1,5 mL Volumen eingesetzt, dessen schmale Spitze abgeschnitten ist. Das Gelstückchen wird in diese Spitze eingelegt. Das Elutionsgefäß wird mit einem porösen Polyethylenstopfen verschlossen. Nach dem Einfüllen des Puffers wird eine Elektrodenkappe aufgesetzt, die mit einer Kathode für das Elutionsgefäß und einer Anode für das Reaktionsgefäß ausgestattet ist. Mit einer speziell dafür konstruierten Elektroapparatur können mehrere Elektroelutionen parallel durchgeführt werden. Die reine Proteinfraktion wird direkt aus dem Reaktionsgefäß entnommen.

Die Methode wird bei Nukleinsäuren kaum mehr verwendet, seit man mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) kleinste Mengen amplifizieren kann; das funktioniert auch mit entnommenen Gelstückchen und ausgekratzten Nukleinsäurebanden. Präparative Methode, wenn Proteine in Reinstform benötigt werden, z. B. für Proteinsequenzierung oder Top-Down-Massenspektrometrie.

Biologische Flüssigkeiten, Gewebeextrakte, Zelllysate.

Für beide Methoden benötigt man einen Stromversorger. Der Vorteil der ersten Methode ist die Verwendung einer Standardvertikalapparatur. Bei der zweiten Methode wird zusätzlich zur Elektrophoreseausrüstung eine weitere Apparatur benötigt.

Hoch, weil eine hochgereinigte Protein- oder DNA-Fraktion gewonnen wird.

Bei der ersten Methode muss man eine Dialysiermembran verwenden, an die das Protein irreversibel adsorbieren kann. Leider ist es in vielen Fällen nicht möglich, alle Proteine quantitativ aus dem Gel zu eluieren.

Elektroelution ist eine Methode für klinisch-chemische und für biochemisch arbeitende Labors.