Antigen (oder Hapten) und Enzym- bzw. Fluoreszenzfarbstoff-konjugiertes Antigen (oder Hapten) konkurrieren um die Bindungsstellen des im Unterschuss vorhandenen Antikörpers (kompetitiver Test; s. Abbildung). Die Bindung des markierten Antigens führt in Abhängigkeit zur Konzentration des (unmarkierten Proben-)Antigens zu
Funktionsprinzip des homogenen Immunoassays (H, Hapten; E
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Physikalisch-chemisches Prinzip
Die Tests sind unempfindlicher als heterogene Immunoassays (Immunoassay, heterogener), aber gebundene und freie (markierte) Antigene (Liganden) müssen vor der Messung nicht getrennt werden. Neben Enzymen und Enzymfragmenten werden häufig Fluoreszenz-Tracer eingesetzt.
Das Testprinzip entspricht dem kompetitiven Immunoassay, ohne Immobilisierung des Antikörpers. Wird das enzymmarkierte Antigen, das mit dem Antigen der Probe um die Bindungsstellen des Antikörpers konkurriert, gebunden, so verringert sich die Enzymaktivität bei Benutzung von Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase oder verstärkt sich bei Malatdehydrogenase, d. h., eine hohe Konzentration in der Probe führt im ersten Fall zu hohen, im zweiten Fall zu niedrigen Enzymaktivitäten.
Das Antigen (Hapten) ist an Galaktosidase-Fragmente gekoppelt und konkurriert mit Probenantigen (Hapten) um die Bindungsstellen des Antikörpers. Antikörperbindung der Fragmentkonjugate verhindert die Assoziation des Enzyms, d. h., wenig Probenantigen löst die Antikörperbindung des Fragmentkonjugats aus und führt zu einem geringen Signal. Wie EMIT wird CEDIA zur Bestimmung von Medikamenten und Drogen eingesetzt.
Der Analyt der Probe konkurriert mit dem Fluorophor-markierten Analyten (als Reagens zugesetzt) um die im Unterschuss vorhanden Bindungsstellen des Antikörpers. Ungebundene Tracer-Analyt-Moleküle drehen sich schnell und emittieren Licht in verschiedenen Polarisationsebenen, wodurch das Signal des polarisierten Lichtes geschwächt wird. Der Immunkomplex dreht sich langsamer und emittiert das polarisierte Licht in derselben Ebene, d. h. hohe Proben-Analyt-Konzentrationen führen zur Signalabschwächung (fallende Eichkurve).
Immunchromatographie
Antikörper gegen ein zu bestimmendes Antigen wird an Celluloseacetatfolien gebunden. Antigen und markiertes Antigen werden aufgetropft und konkurrieren um die Antikörperbindungsstellen. Ungebunden Tracer-Antigen-Moleküle diffundieren aus der Bindungszone und werden z. B. mit Substrat detektiert. Durch die Konzentrierung des Tracers in einer diskreten Zone der Folie steigt die Sensitivität. Zur Immunchromatographie gehören die sog. Dot-Blot-Verfahren.
Einsatzgebiet
Bestimmung von Haptenen, Antigenen und Antikörpern. Besonders geeignet für die Bestimmung von Haptenen und Antigenen mit geringer Molekülgröße (Arzneimittel, Drogen, Hormone).
Geräte zur manuellen und automatisierten Bearbeitung und Detektion mit folgenden Messverfahren (fotometrisch, fluoreszenzfotometrisch, luminometrisch).
Sensitivität
Abhängig vom Detektionsverfahren zwischen 10−16 mol/L (Farbdetektion) und 10−20 mol/L (Chemilumineszenz).
Spezifität
Die Antikörper zeigen oft Kreuzreaktivitäten, sodass eine Angabe dieser Unspezifität für eine Vielzahl ähnlicher Substanzen (besonders bei Arzneimitteln und Drogen) erforderlich ist.
Fehlermöglichkeit
Homogene Immunoassays erfassen z. B. bei Drogenbestimmungen infolge der Kreuzreaktivität neben der aktiven Substanz auch Abbauprodukte, die weniger biologisch aktiv oder bio-inaktiv sind. Fibrinogen in Plasma führt häufig zu Störungen.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Die Durchführung erfolgt in der Regel an Automaten.
Literatur
Greiling H, Gressner AM (1994) Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie, 3. Aufl. Schattauer, Stuttgart, S 159–171
