Western blot

Immunoblot

western blotting

Der Western blot ist eine Methode zur elektrophoretischen Auftrennung komplexer Proteingemische mit nachfolgender Übertragung der Proteinbanden auf eine Trägerfolie und deren immunologische Detektion und Identifizierung.

In einem ersten Schritt wird das zu analysierende Proteingemisch mit einer geeigneten Elektrophoresetechnik (Elektrophorese) wie SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE; SDS-Elektrophorese), native Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE), isoelektrische Fokussierung oder zweidimensionale Gelelektrophorese (Elektrophorese, zweidimensionale) aufgetrennt. Anschließend erfolgt in einem als Blotting bezeichneten zweiten Schritt, senkrecht zur ersten Laufrichtung, die elektrophoretische Übertragung der getrennten Proteinbanden auf eine Trägerfolie, bei der auch SDS (sodium dodecylsulfat) abgewaschen wird und die Proteine teilweise renaturiert werden. In einem dritten Arbeitsschritt werden die geblotteten Proteine auf der Trägerfolie mit spezifischen Antikörpern detektiert, die durch einen sekundären Antikörper sichtbar gemacht werden. Das gelingt durch den Einsatz markierter sekundärer Antikörper, die mit Enzymen, (Fluoreszenz-)Farbstoffen oder Radioaktivität (mit nachfolgender Autoradiografie) konjugiert sind. Mit einem als Stripping bezeichneten Verfahren ist es möglich, die Antiköper von den Proteinen wieder zu entfernen und für weitere Analysen einzusetzen.

Die weitgehend standardisierte, empfindliche Methode ist zur Analyse komplexer Proteingemische gut geeignet und erlaubt gegebenenfalls zusätzliche funktionelle Untersuchungen einzelner Polypeptide/Proteine.

Proteingemische jeglicher Art.

Entsprechende Vorrichtungen und Apparaturen zur Elektrophorese, zum Blotten und zur Auswertung.

Durch den Einsatz spezifischer mono- oder polyklonaler Primärantikörper und Vermeidung unspezifischer Antikörperbindungen durch Waschungen mit Detergenzien oder Blockierung unspezifischer Bindungsstellen ist eine hohe Spezifität gegeben.

Die Methode zeichnet sich durch eine hohe analytische Sensitivität aus, die auch von der Nachweismethode (Lumineszenz, Farbreaktion, Autoradiographie) und vom Molekulargewicht des zu detektierenden Polypeptids/Proteins abhängig ist.

Sind grundsätzlich in allen 3 Teilschritten gegeben und reichen vom Blotten über die Detektion bis zur Verwendung nicht geeigneter Primärantikörper.

Weitgehend standardisierte, ausgereifte und praktikable, aber nicht automatisierte, personal- und kostenaufwendige Methode.

Es handelt sich um eine in Forschung und erweiterter, differenzierter Labordiagnostik eingesetzte Methode hoher analytischer Spezifität und analytischer Sensitivität.