SDS ist ein anionisches Detergenz. Bei der SDS-Elektrophorese werden SDS-Protein-Komplexe in einem restriktiven Polyacrylamidgel nach Molmassen getrennt.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Natriumdodecylsulfat (SDS) ist sehr starkes anionisches Detergenz, das fast alle Proteine in Lösung bringen kann, auch sehr hydrophobe. Es denaturiert die Proteine, indem es deren Wasserstoffbrückenbindungen (s. Wasserstoffbrückenbindung) öffnet und die Sekundär- und Tertiärstrukturen auflöst. SDS und die Proteine bilden Komplexe mit einer halskettenartigen Struktur, die sich aus Mizellen, die mit Proteinen „dekoriert“ sind, und kurzen, flexiblen Polypeptidsegmenten zusammensetzt. In einem solchem Komplex sind 1,4 g SDS pro g Protein enthalten. Die elektrophoretische Mobilität (Beweglichkeit) eines SDS-Protein-Komplexes ist ausschließlich abhängig von der Molekülgröße; die Eigenladungen der Proteine sind durch SDS abgedeckt. Die negative Ladung pro Masseneinheit ist konstant. Wenn zusätzlich noch die Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen mit einem Reduktionsmittel, wie β-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol, aufgelöst werden, wird die Molekülgröße direkt proportional zur Molmasse.
Bei einer Auftrennung einer Mischung von SDS-Protein-Komplexen in einem SDS-enthaltenden Polyacrylamidgel haben die Logarithmen der Molmassen der Polypeptide eine lineare Beziehung zu ihren relativen Wanderungsstrecken. Die Molmassen werden über eine Eichkurve bestimmt, die mithilfe von parallel aufgetrennten Molmassestandard-Proteinen für jedes SDS-Gel erstellt wird.
Molmassen von Proteinen können mit der SDS-Elektrophorese nur dann korrekt bestimmt werden, wenn die Probe reduziert worden ist. Allerdings zerfallen dann Proteine mit Quartärstrukturen in ihre Untereinheiten; z. B. findet man von IgG nur noch die leichten und schweren Ketten, nicht aber das intakte IgG-Molekül. Es gibt Anwendungen, in denen die Proben nichtreduziert aufgetrennt werden, um Immunglobuline als ganze Moleküle zu erhalten.
In der folgenden Abbildung sind Serumproteinspuren reduziert und nichtreduziert nebeneinander in einem SDS-Gel zu sehen. Auftrennung von (1) Humanserum nichtreduziert, (2) Humanserum reduziert, (3) Standard für niedrige Molmassen, (4) Standard für niedrige Molmassen mit Collagenhydrolysaten versetzt, (5) Standard für hohe Molmassen. Das nichtreduzierte Albumin ist nicht komplett aufgefaltet und wandert deshalb schneller als das Albumin in reduziertem Serum und Standard. In der nichtreduzierten Probe findet man die kompletten IgG, in der reduzierten ist es in leichte und schwere Ketten zerfallen (Coomassie-Färbung):
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Die SDS-Elektrophorese wird in basischen Puffersystemen durchgeführt, weil dann die SDS-Protein-Komplexe stabil und negativ geladen sind. Normalerweise werden Polyacrylamidgele verwendet; nur in Ausnahmen, z. B. zur Auftrennung von Von-Willebrand-Faktor, kommen wegen der hohen Molmassen Agarosegele zum Einsatz. Die Trennungen können, wie bei der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese, in vertikalen oder horizontalen Systemen durchgeführt werden. In der SDS-Elektrophorese wandern alle Proteine, auch basische, in Richtung Anode. Im Gegensatz zu Nativelektrophoresen (Elektrophorese) ergibt sich nur eine Bande pro Enzym. Die Trennungen sind aufgrund der hohen Ladungsdichte der SDS-Protein-Komplexe relativ schnell. Die Trennschärfe ist aufgrund der starken Siebeigenschaften der Polyacrylamidgele und der Auffaltung der Proteinmoleküle sehr hoch, wodurch sich zudem ein hohes Auflösungsvermögen ergibt.
Die Proteine werden entweder mit Coomassie-Färbung oder Silberfärbung visualisiert. Die SDS-Elektrophorese ist die Standardtrennmethode für Blotting-Techniken.
Interessante Anwendungen mit SDS-Substratgelen sind z. B. die zymografische Detektion von Matrix-Metalloproteinasen in SDS-Gelen, die Gelatine oder Kollagen enthalten.
Sammelurin: aufkonzentriert (Coomassie-Färbung) oder nichtkonzentriert (Silberfärbung). Blotting: z. B. allergenenthaltende Proben, Borellioseerreger. Bronchiallavage.
Instrumentierung
Elektrophoresekammer: vertikal oder horizontal (mit Umlaufkryostat)
Die meisten Fehler ergeben sich bei der Selbstherstellung von Gelen und Puffern. Diese können durch die Verwendung kommerzieller Fertiggele und Fertigpuffer weitgehend ausgeschlossen werden.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Mit Fertiggelen und Färbeautomaten ist die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese einfach durchzuführen. Es gibt automatisierte Elektrophoresesysteme. Die Geräte selbst sind relativ preiswert, während die Verbrauchsmaterialien wie Fertiggele, Puffer und Färbereagenzien die meisten Kosten verursachen.
