DigiWest Blotting

Auf Immunassay-Kügelchen basierender Western Blot

DigiWest Bead-based Western Blotting

Western-Blotting-Methode auf einer automatischen Multiplex-Plattform, die auf Immunassays mit Kügelchen basiert und hunderte Replikas des originalen Blots erzeugt.

Nach der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese werden die Proteine mittels Elektrotransfer auf eine Blotmembran übertragen. Nachdem die immobilisierten Proteine biotinyliert wurden, wird die Blotmembran getrocknet, in die individuellen Trennspuren zerschnitten und diese jeweils in 96 Streifchen geschnitten. Diese Größenfraktion-Streifchen (0,5 × 6 mm) werden in die verschiedenen Näpfchen einer Mikrotiterplatte transferiert. Dann werden die Proteine mit einem Elutionspuffer (8 mol/L Harnstoff, 1 % Triton X-100 in 100 mmol/L Tris-HCl pH 9,5) von dem Membranmaterial abgelöst. Nun werden die Näpfchen mit 96 verschiedenen Neutravidin-beschichteten Luminex-Kügelchen beladen und die biotinylierten Proteine an die Oberflächen der Kügelchen gebunden. Diese Kügelchen sind farbenkodiert; damit kann man die Molekülgröße einem definierten Farbenkode zuordnen. Die zusammengemischte Sammlung von Kügelchen ist äquivalent zu einer rekonstituierten und digitalisierten Trennspur eines Western Blots. Eine Proteinmenge 5–20 μg ist ausreichend für hunderte routinemäßige Antikörperreaktionen. Die Ergebnisse sind digitaler Natur: daher der Name DigiWest.

DigiWest ist ein automatisches Analysensystem, das parallel viele unterschiedliche Proteine von sehr kleinem Probenmaterial bestimmen kann. Die Methode ermöglicht umfangreiche Analysen von limitierten Probenmengen, wie z. B. von Zellen, die mit Lasermikrodissektion gewonnen wurden, und die Ausweitung der Western-Blotting-Methode zu Proteomik Größenordnungen. Die Kombination von Molekülgrößeninformation, Empfindlichkeit und der Linearität des Signals auf einer automatisierten Plattform erlaubt die Quantifizierung hunderter spezifischer Proteine und Proteinmodifizierungen in komplexen Proben auf einmal.

Biologische Flüssigkeiten, Gewebematerial aller Art, Zellkulturen, Zellen, die mit Lasermikrodissektion gewonnen wurden.

Ausrüstung für Polyacrylamidgel-Elektrophorese bestehend aus Minivertikalkammer, Stromversorger und Blottingapparatur; Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- oder Nahe Infrarot-CCD-Kamerasystem; Silhouette SD-elektronische Schneidemaschine (Silhouette America, West Orem, UT, USA); Thermomixer; FlexMAP 3D Instrument (Luminex).

Sehr hoch, weil die Methode auf Immunassays und Molekülgrößentrennung basiert.

Im einstelligen Femtomolbereich.

Fehler bei der Elektrophorese können bei Verwendung von Fertiggelen minimiert werden. Für den Elektrotransfer bei Western Blotting können fertige Pufferkits eingesetzt werden.

Relativ aufwendige Methode, Auswertung der Kügelchen ist automatisiert.

Geeignet für spezialisierte klinisch-chemische Labors mit sehr hohem Probendurchsatz.