Lymphozyten-Proliferation

Lymphozytentransformationstest; LTT

lymphocyte proliferation assay; lymphocyte transformation assay

In-vitro-Test mit vitalen Lymphozyten, die durch Antigen- oder Mitogenzugabe zur Proliferation angeregt werden. Die Proliferation der Lymphozyten kann durch verschiedene Methoden nachgewiesen werden.

Zunächst werden mononukleäre Zellen aus heparinisiertem Vollblut über Dichtegradientenzentrifugation isoliert und dann mit dem fraglichen Allergen/Antigen oder Mitogen inkubiert und deren Proliferation gemessen.

Zur Proliferationsmessung kann der Einbau von 3H-Thymidin in die genomische DNA mit anschließender Messung der emittierten β-Strahlung genutzt werden. Neuere Methoden verwenden Oberflächenmarker aktivierter CD4-positiver Lymphozyten, wie z. B. CD69, das durch fluoreszenzmarkierte Antikörper durchflusszytometrisch gemessen wird.

Als Kontrollprobe sollte in jedem Ansatz eine Probe eines gesunden Spenders mitgeführt werden. Zusätzlich sollten die isolierten Lymphozyten mit dem Lösungsmittel des Allergens/Mitogens zur Kontrolle der Spontanproliferation inkubiert werden.

Ersatzmethoden für radioaktive Proliferationsmessungen sind auf dem Vormarsch. Gemessen werden (Fluoreszenz-)Farbstoffe, die in proliferierende Zellen eingebracht werden.

Alle antigenspezifischen Immunreaktionen, auch Allergien, werden durch T-Zellen reguliert. Periphere sensibilisierte CD4-T-Zellen können besonders zur Diagnostik von Medikamentenallergien herangezogen werden, da sie nicht immer IgE-vermittelt sind und so nicht in RAST- oder Basophilen-Degranulationstests zu diagnostizieren sind.

Klassischer Test für T-Zell-vermittelte Allergien vom Spättyp ist die Epikutantestung. Bei negativem Testergebnis kann der Lymphozytenproliferationstest, als Voraussetzung einer Hautreaktion, direkt als Zeichen für eine substanzspezifische Aktivierung der T-Zellen eingesetzt werden. Der Test kann prinzipiell für alle wasserlöslichen Medikamente durchgeführt werden. Viele dieser Medikamente und deren Metabolite liegen als Haptene vor. Der physiologische Mechanismus der T-Zell-Aktivierung über Haptene ist noch nicht endgültig geklärt. Dennoch ermöglicht der LTT eine diagnostische Aussage.

Als Marker für die Proliferation der CD4-T-Zellen kann die DNA-Synthese, indirekt über den Einbau von 3H-Thymidin, herangezogen werden. Die maximale DNA-Synthese wird in vitro innerhalb 72–150 Stunden nach Antigenexposition erwartet. Schneller ist die Proliferation durchflusszytometrisch über Markierung verschiedene Oberflächenmarker zu detektieren. CD69 ist der bei Aktivierung von Lymphozyten am schnellsten (bereits innerhalb von 8Stunden) ansteigende Oberflächenmarker. Andere Aktivierungsmarker wie CD25 (IL-2-Rezeptor), CD71 (Transferrinrezeptor) oder HLA-DR werden erst später exprimiert.

10–20 mL Heparinblut.

Lagerung bei Raumtemperatur. Die Untersuchung sollte innerhalb von 24 Stunden durchgeführt werden.

2,5–3-fach gesteigerte Proliferationsrate der Lymphozyten gegenüber der Negativ- und Gesundkontrolle bei Antigenstimulation.

Ein Lymphozytenproliferationstest sollte nur nach sorgfältiger Indikationsstellung und Anamneseerhebung durchgeführt werden. Nur so sind spezifische und sensitive Testergebnisse möglich. Er ermöglicht vor allem Aussagen über T-Zell-vermittelte Reaktivität in einem Zeitraum von 14 Tagen bis 3 Monaten nach dem Ereignis. Bei negativem Epikutantest bietet er die Möglichkeit, eine Sensibilisierung auf zellulärer Ebene zu diagnostizieren.

Der Einsatz verschiedener Kontrollproben in jedem Testansatz erleichtert die individuelle Festlegung eines Cut-off für jeden Patienten. Dennoch sind zweifelhafte Ergebnisse zu erwarten, die nur von erfahrenen Untersuchern interpretiert werden sollten.

Die aufwendige Präanalytik und Analytik stellen hohe Anforderungen. Der Test sollte daher nur von Laboratorien durchgeführt werden, die über entsprechende Erfahrung verfügen.

Der LTT stellt eine komplexe und daher, auch bei korrekter Indikation, sehr von der Erfahrung des Untersuchers abhängige Testmethode dar. Sensitivität und Spezifität lassen sich durch genaue Anamneseerhebung und damit möglichst exakt eingegrenzte Fragestellung verbessern. Die Interpretation der Testergebnisse sollte anhand der mitgeführten Kontrollen erfolgen.