Interphase-FiSH

Analyse nicht-kondensierter DNA-Fäden mittel fluoreszenzmarkierter DNA-Sonden

interphase fluorescence in-situ hybridisation

Interphase-FiSH (Interphase-Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierung) ist eine molekular-zytogenetische Methode, chromosomale Störungen oder Aberrationen durch Hybridisierung der dekondensierten zellulären DNA mit definierten fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden hochauflösend nachzuweisen.

Während die klassische Zytogenetik meist teilungsfähige Zellen kultiviert, um diese in der Mitose zu arretieren und die Chromosomen einer Strukturanalyse zugänglich zu machen, kann die molekulare Zytogenetik zahlreiche Fragestellungen mittels FiSH auch an der dekondensierten Interphase-DNA sichtbar machen, als Interphase-FiSH. Bei der Interphase-FiSH-Methode entfallen die aufwendigen Zellkulturen. Man kann die Analysen direkt an Blut- bzw. Zellausstrichen oder auch Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebepräparaten zügig und zeitsparend durchführen. Vom Prinzip werden die vorbereiteten Objektträger mit den ausgestrichenen Zellen oder den FFPE-Gewebeschnitten zunächst denaturiert, um die Interphase-DNA einzelsträngig vorliegen zu haben. Anschließend werden die Präparate mit einer zugegebenen fluoreszenzmarkierten DNA-Sonde über mehrere Stunden inkubiert (hybridisiert). Nach abgeschlossener Hybridisierung erfolgen mehrere Waschungen der Objektträger mit unterschiedlicher Stringenz und die anschließende Einbettung mit Deckgläschen. Eine Auswertung erfolgt am Fluoreszenzmikroskop.

Bei dieser Analyse ist eine sorgfältige und auf die Fragestellung hin abgestimmte Auswahl der FiSH-Sonden nötig. Die FiSH-Sonden sind i. d. R. mit 2 Fluoreszenzfarben markierte DNA-Fragmente, die sich vom Konstrukt her unterscheiden. So gibt es beispielsweise Dual-Fusion-Sonden, bei denen 2 unterschiedlich fluoreszenzmarkierte Gene oder Chromosomenabschnitte bei der Hybridisierung im Normalfall 2 × 2 unterschiedliche Signale, im pathologischen Fall jedoch neben jeweils einem Einzelsignal für die normalen Genabschnitte auch 2 überlappende Signale für reziproke Chromosomentranslokationen bzw. Genfusionen (z. B. BCR-ABL bei CML) zeigen.

Ein anderes Beispiel sind die Break-apart-Sonden, bei denen 2 unterschiedlich fluoreszenzmarkierte, ca. 100 kb entfernte DNA-Abschnitte rund um einen etablierten Bruchpunkt auf dem Chromosom bei der Hybridisierung im Normalfall 2 überlappende Signale zeigen. Im pathologischen Fall jedoch bei Vorliegen eines Bruch- oder Insertionsereignisses finden sich neben einem überlappenden Signal zusätzlich 2 je farblich unterschiedliche Signale als Hinweis auf das Auseinanderbrechen („break apart“) der DNA-Struktur des Gens bzw. DNA-Abschnitts (z. B. EML4-ALK bei NSCLC).

Eine weitere Variante ist die lokusspezifische Sonde, die zum einen einen zentromerspezifischen Abschnitt, zum anderen einen mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markierten Gen- oder lokusspezifischen Abschnitt enthält. Im Normalfall finden sich im Interphasepräparat 2×2 separate Signale für Zentromer und Gen bzw. Lokus. Im pathologischen Fall, wenn eine heterozygote Deletion vorliegt, fehlt ein gen- bzw. lokusspezifisches Signal und es sind nur 3 Signale zu sehen (z. B. Williams-Beuren-Syndrom). Kommt es hingegen im pathologischen Fall zu einer Amplifikation, liegen die gen- bzw. lokusspezifischen Signale mehrfach vor (z. B. Her2-Amplifikation).