Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik
Autoren
R. Westermeier

Elektrophorese, zweidimensionale

Elektrophorese, zweidimensionale
Synonym(e)
2-D-Elektrophorese; Zweidimensional-Elektrophorese
Englischer Begriff
two-dimensional electrophoresis
Definition
In der zweidimensionalen Elektrophorese werden komplexe Proteingemische nach 2 unterschiedlichen, voneinander unabhängigen physikochemischen Parametern aufgetrennt: erst nach Ladungen mit der isoelektrische Fokussierung (IEF), dann nach Molekülgrößen mit der SDS-Elektrophorese. Das Ergebnis ist ein Fleckenmuster.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Um komplexe Proteingemische mit hoher Auflösung und guter Reproduzierbarkeit auftrennen zu können, werden denaturierende Bedingungen angewandt. Das bedeutet, dass die Probe mit 8 mol/L Harnstoff, einem Reduktionsmittel, einem zwitterionischen Detergenz und einem Trägerampholytengemisch versetzt oder extrahiert wird.
Genügend hohe Auflösung für komplexe Proteingemische erhält man nur in Gelen mit großen Trenndistanzen, z. B. 20 × 20 cm.
Die Proteinproben werden in der ersten Dimension mit isoelektrischer Fokussierung (s. isoelektrische Fokussierung) nach der Ladung getrennt. In der traditionellen Technik geschah dies in Trägerampholyt-pH-Gradienten in dünnen Polyacrylamidgelen in Röhrchen. In der modernen Technik verwendet man foliengestützte Polyacrylamidgelstreifen mit immobilisierten pH-Gradienten. Diese sind kommerziell erhältlich in verschiedenen Längen mit weiten pH-Gradienten (pH 3–11) und engeren pH-Gradienten für noch höhere Auflösung.
Nach einer Äquilibrierung des Gels der ersten Dimension wird es auf ein SDS-Gel aufgelegt und mit Agarose eingebettet. Daraufhin erfolgt die Trennung in der SDS-Elektrophorese nach Molmasse. Bei der Färbung wird ein Fleckenmuster sichtbar (Abb. 1).
Die Muster werden mit geeigneten Programmen ausgewertet; visuelle Auswertung solch komplexer Ergebnisse ist praktisch unmöglich.
Zweidimensionale Differenz-Gelelektrophorese: Es ist auch möglich die Proteine verschiedener Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorophor) zu markieren, welche die isoelektrischen Punkte (s. isoelektrischer Punkt) nicht modifizieren. Die Proben werden daraufhin zusammengemischt und im selben Gel aufgetrennt. Weil die Fluorophore in etwa die gleichen Molmassen haben, wandern die gleichen Proteine der verschiedenen Proben zu exakt denselben Positionen im SDS-Gel. Mithilfe eines Multifluoreszenz-Densitometers werden die verschiedenen Fluorophoren nacheinander bei unterschiedlichen Wellenlängen angeregt und die emittierten Signale aufgezeichnet. Diese Methode ermöglicht den Vergleich von komplexen Proteingemischen unter Ausschluss von Gelvariabilitäten. Die eigentliche Stärke bei dieser Methode liegt bei der Verwendung eines inneren Standards für jedes Protein: Hierzu mischt man vor der Fluoreszenzmarkierung Aliquots von jeder Probe zu einem gepoolten Probenstandard zusammen und markiert diesen mit einem der verfügbaren Fluoreszenzmarker. Bei jeder Trennung wird dieser Standard mitgeführt. Zur Auswertung werden die Ergebnisse auf die Signale des internen Standards bezogen. Dies führt zu sehr verlässlichen quantitativen Ergebnissen mit hoher statistischer Zuverlässigkeit.
Die Identifizierung und Charakterisierung von auffälligen Proteinen erfolgt durch Massenspektrometrie.
Wegen ihres sehr hohen Auflösungsvermögens von mehreren tausend Proteinen in einem Gel ist die Zweidimensional-Elektrophorese die wichtigste Trenntechnik in der Proteomik.
Die folgende Abbildung zeigt eine zweidimensionale Elektrophorese von Melanoma-Zellextrakt (Proteindetektion mit Silberfärbung):
Einsatzgebiet
Die Methode ist zu komplex für Routineanalysen und wird hauptsächlich in der Proteomforschung angewandt zur
  • Detektion von Krankheitsmarkern,
  • Aufklärung von Erkrankungsursachen,
  • Auffindung von Arzneimitteltargets,
  • Beobachtung von Therapien,
  • Entwicklung von personenspezifischen Therapien.
Untersuchungsmaterial
  • Körperflüssigkeiten: z. B. Serum, Plasma, Liquor, Urin, Semen
  • Zellkulturen
  • Gewebe: gesunde Zellen und Krebszellen, Gehirn, Leber, Niere, Herzmuskel
Instrumentierung
Der Geräteaufwand ist relativ hoch:
  • Spezialgerät für isoelektrische Fokussierung in Gelstreifen
  • Vertikale SDS-Elektrophorese-Apparatur für große Gele
  • Stromversorger
  • Kühlthermostat
  • Densitometer oder Scanner für zweidimensionale Elektrophorese
  • Spezielle Auswerteprogramme und entsprechende DV-Möglichkeiten
Spezifität
Die Spezifität der Ergebnisse wird deutlich erhöht durch zweifelsfreie Identifizierung von Proteinen mit Blotting und/oder Massenspektrometrie.
Sensitivität
Man kann Proteine in pg-Mengen detektieren.
Fehlermöglichkeit
Da die Durchführung relativ komplex ist, ergeben sich viele Fehlermöglichkeiten. Durch die Anwendung der Differenz-Gelelektrophorese mit fluoreszenzmarkierten Proteinen werden die Auswirkungen von Fehlern deutlich reduziert.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Die Methode ist relativ teuer. Es gibt Ansätze zur teilweisen Automatisierung des Arbeitsablaufs.
Literatur
Lottspeich F, Engels JW (Hrsg) (2012) Bioanalytik, 3. Aufl. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg
Rabilloud T (Hrsg) (2000) Proteome research: two-dimensional gel electrophoresis and identification methods. Springer, Berlin/Heidelberg/New York