Partikel-verstärkter nephelometrischer Immunoassay
Partikel-verstärkter nephelometrischer Immunoassay
Synonym(e)
PENIA
Englischer Begriff
particle enhanced nephelometric immunoassay
Definition
Basierend auf dem Prinzip der Immunnephelometrie werden Latexpartikel mit Antikörpern (s. Antikörper) oder Antigenen (s. Antigen) beladen und mit dem zu messenden Analyten (s. Analyt) in Kontakt gebracht. Die entstehenden Agglutinate werden mittels Streulichtmessung erfasst. Je höher die Konzentration des Analyten, desto zahlreicher und größer sind die streuenden Partikelagglutinate und umso höher ist das Streulichtsignal. Vorzugsweise werden mit Antikörpern beladene Partikel eingesetzt.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Antikörper werden nach dem sog. Schale-Kern-Verfahren meist kovalent an Polystyren-Latexpartikel mit einer Größe von 180–250 nm gebunden. Hierzu wird der Polystyrenkern, der eine hohe optische Dichte aufweist, mit einer dünnen hydrophilen Schicht (5–10 nm) aus einem Copolymer aus vorzugsweise Methacrylaten überzogen, an die die kovalente Bindung der Antikörper erfolgt. Für die kovalente Bindung stehen in Abhängigkeit von dem eingesetzten Copolymer vor allem Aldehyd-, Carboxyl-, Amino- und Amidgruppen zur Verfügung. Die Schale-Kern-Methode zeichnet sich durch 2 Vorteile aus:
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Die negative Ladung der dünnen Schale verhindert eine Eigenagglutination der Latex-Partikel.
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Sie gestattet die bereits erwähnte kovalente Immobilisierung der Antikörper, die eine stabile Bindung der Antikörper zur Folge hat.
Die so immobilisierten Antikörper bilden mit den Antigenen ein dreidimensionales Netzwerk analog der klassischen Latex-Agglutination aus. Die so entstandenen Agglutinate werden nach dem gleichen physikalischen Prinzip wie in der Immunnephelometrie mittels Streulichtmessung erfasst. Die Reaktion folgt im Wesentlichen der Heidelberger-Kurve, sodass das Streulichtsignal mit zunehmender Antigenkonzentration und somit zunehmender Zahl und Größe der Partikel deutlich zunimmt. Da das Streulichtsignal mit der sechsten Potenz des Partikeldurchmessers ansteigt, ergibt sich eine erhebliche Verbesserung der Sensitivität gegenüber der klassischen Partikel-freien Immunnephelometrie um den Faktor 1000.
Die eingesetzten Antikörper sowie die zu bestimmenden Antigene müssen mindestens 2 Bindungsstellen (Paratope bzw. Epitope) aufweisen, um ein dreidimensionales Netzwerk bilden zu können. Deshalb werden als Antikörper vorzugsweise polyklonale Antikörper eingesetzt. Eine Bestimmung von Haptenen ist in der Regel nicht möglich. Diese lassen sich mit einem Partikel-verstärkten Immuninhibitionstest nachweisen, bei dem sich die Sensitivität gegenüber dem direkten Verfahren nochmals um den Faktor 10 steigern lässt. Hierbei werden definierte Mengen an mit Antigen oder Hapten beschichteten Latexpartikeln mit den korrespondierenden Antikörpern agglutiniert und die Agglutination durch das freie Antigen/Hapten in der zu bestimmenden Probe inhibiert. Das Streulichtsignal ist somit reziprok proportional zu der Konzentration des Analyten.
Einsatzgebiet
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Serumproteine wie CRP, Myoglobin, β2-Mikroglobulin, IgE, Cystatin C u. a.
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Hormone wie HCG, Östriol, Östradiol, Kortisol u. a.
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Pharmaka wie Theophyllin, Phenobarbital u. a.
Instrumentierung
Nephelometer, Immunnephelometrie.
Spezifität
Spezifität und Reinheit des eingesetzten Antikörpers bzw. der eingesetzten Antigene/Haptene bestimmen die Spezifität der jeweiligen Analysenmethode. Hierbei sind Kreuz- oder Multireaktivitäten auszuschließen. Rheumafaktoren sind per se Störfaktoren von Latexagglutinationstesten, da die an der Oberfläche von Partikeln in hoher Dichte gebundenen Antikörper vom IgG-Typ von Rheumafaktoren als alteriertes IgG erkannt werden. Diese müssen durch Zugabe von Kaninchen-IgG absorbiert werden. In seltenen Fällen können Autoantikörper Epitope der zu bestimmenden Antigene maskieren.
Sensitivität
Ca. 0,005 mg/L (Methoden- und parameterabhängig); Immuninhibitionstest: 0,5 μg/L.
Fehlermöglichkeit
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Bewertung – Methodenhierarchie (allg.)