Anzeige
Erschienen in:
01.11.2010 | Originalien
Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie des retinalen Pigmentepithels mittels strukturierter Beleuchtung
Erschienen in: Die Ophthalmologie | Ausgabe 11/2010
Einloggen, um Zugang zu erhaltenZusammenfassung
Hintergrund
Die Akkumulation autofluoreszierender Substanzen innerhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE) ist für die Pathogenese beispielsweise der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) relevant. Bisherige fluoreszenzmikroskopische Techniken erlauben die In-vivo-Darstellung von Fluorophoren des Augenhintergrunds im Mikrometerbereich, Ex-vivo-Untersuchungen erreichen derzeit Auflösungen bis 200 nm. Wir stellen hier erstmals die Ex-vivo-Anwendung der strukturierten Beleuchtung als eine spezielle Form der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie an Zellen des RPE dar.
Methoden
Vom Bulbus eines 68-jährigen Patienten wurden histologische Schnitte hergestellt. Mit Hilfe der Epifluoreszenzmikroskopie konnten fluoreszierende RPE-Zellen markiert werden. Die strukturierte Beleuchtung benutzt eine inhomogene Beleuchtung, um primär nicht auflösbare Strukturen, in Analogie zum Moiré-Effekt, auflösbar zu machen. Damit wurden von RPE-Zellen bei verschiedenen Anregungswellenlängen (488, 568 und 647 nm) Aufnahmen angefertigt und mittels spezieller Software rekonstruiert. Die verschiedenen Anregungsmuster der fluoreszierenden Granula in den RPE Zellen wurden zusätzlich farblich kodiert und ausgewertet.
Ergebnisse
Mittels strukturierter Beleuchtung können Autofluoreszenzsignale des RPE detektiert werden. Autofluoreszierende Strukturen lassen sich lateral mit einer Auflösung von 110 nm (488 nm Anregung) darstellen. Durch die Verwendung verschiedener Wellenlängen können nacheinander unterschiedliche Pigmente zur Autofluoreszenz angeregt werden. Lipofuszin zeigt v. a. bei 488 nm und 568 nm Signale. Die verbesserte Auflösung ermöglicht außerdem die Darstellung intragranulärer Ansammlungen von Fluorophoren und weist auf eine inhomogene Zusammensetzung hin.
Schlussfolgerung
Die Anwendung der strukturierten Beleuchtung ermöglicht die Darstellung fluoreszierender Strukturen in RPE-Zellen ex vivo in einer bisher nicht möglichen Auflösung von 110 nm. Intrazelluläre Fluoreszenzmuster in einzelnen Zellkompartimenten lassen sich visualisieren und durch Verwendung verschiedener Anregungswellenlängen weiter auftrennen.