In-vitro-Fertilisation und intrazytoplasmatische Spermieninjektion
Verfasst von: Thomas Ebner und Klaus Diedrich
Konnten anfänglich nur Paare mittels konventioneller IVF behandelt werden, bei denen eine tubare oder unerklärte Sterilität vorlag, erlaubte die Entwicklung invasiverer Befruchtungstechniken (z. B. der ICSI) letztendlich auch eine Therapie bei ausgeprägtem männlichem Faktor. Erst nach der Gewinnung der Cumulus-Eizell-Komplexe wird anhand der Samenqualität des Partners entschieden, welche Technik angewandt wird. Die herkömmliche IVF ist im Wesentlichen der in vivo stattfindenden Befruchtung nachempfunden, d. h., in einem Kulturschälchen werden die Eizellkomplexe mit einer festgelegten Zahl an Spermien versetzt und traditionellerweise über Nacht inseminiert. Bei einer ICSI hingegen müssen vor der geplanten Injektion die die Eizelle umgebenden Cumuluszellen enzymatisch/mechanisch entfernt werden. Das mittels unterschiedlichster Präparationstechniken gewonnene Spermium muss vor Verwendung immobilisiert werden.
Die Geburt von Louise Brown (Steptoe und Edwards 1978) war der Meilenstein in der Geschichte der assistierten Reproduktion und zugleich Startschuss für intensive Forschung auf diesem Gebiet (Kap. „Historischer Abriss zur Reproduktionsmedizin“). Anfänglich konnten natürlich lediglich Paare behandelt werden, bei denen die Samenqualität nicht oder nur in geringem Ausmaß beeinträchtigt war. Schwerere Formen männlicher Subfertilität konnten in diesen Tagen nicht therapiert werden. Dies hatte zur Folge, dass weltweit Forscher danach trachteten, bei reduzierter Samenqualität die Spermien näher zur eigentlichen Eizelle zu bringen, als es bei der herkömmlichen IVF üblich war. Zum Teil mit ersten Erfolgen, wie die Entwicklung der partiellen Zona-Dissektion (Cohen et al. 1988) und der subzonalen Injektion (Ng et al. 1988) beweisen.
Aber erst die Implementation der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) (Palermo et al. 1992) ermöglichte es endlich, nahezu alle Paare zu behandeln, sofern man zumindest ein funktionelles Spermium aus dem männlichen Urogenitaltrakt isolieren kann. Dabei ist interessanterweise die Technik bis dato mehr oder weniger unverändert geblieben, bestenfalls für bestimmte Indikationen modifiziert worden. Allerdings hat sich im Laufe der Jahre herauskristallisiert, dass man Spermien aus den unterschiedlichsten Quellen für eine ICSI heranziehen kann. So ist es mittlerweile Standard, Spermien durch testikuläre Extraktion (TESE) zu gewinnen (Silber et al. 1994), mitunter wird auch noch eine Aspiration von Spermien aus der Epididymis (MESA) praktiziert (Patrizio et al. 1988). Material, das mittels MESA gewonnen wird, kann bei entsprechender Motilität auch für eine IVF herangezogen werden.
Längst ist ja bekannt, dass bei der IVF aufgrund der noch notwendigen Penetration des Cumulus-Eizell-Komplexes, der Zona pellucida, des perivitellinen Spaltes sowie der Eimembran der Befruchtungsvorgang um 2–3 h länger dauern kann, was bei der Beurteilung des Vorkernmusters berücksichtigt werden sollte (Montag et al. 2001). Weiters ist es ratsam, dass im Falle einer ICSI der Zeitraum zwischen Eizellgewinnung und Injektion 6 h nicht überschritten werden, um ein vorzeitiges Altern der Eizellen zu verhindern (Van de Velde et al. 1998; Dozortsev et al. 2004). In diesem Zusammenhang scheint es nicht von Relevanz zu sein, ob die Cumulus-Eizell-Komplexe (COC) unmittelbar nach der Punktion enzymatisch denudiert werden und dann einige Stunden bis zur ICSI gewartet wird, oder ob die Denudation unmittelbar vor einer solchen Prozedur durchgeführt wird (Van de Velde et al. 1998). Da Cumuluszellen ja eine wichtige Rolle in der Reifung und Versorgung der weiblichen Gameten einnehmen, tendiert die Mehrheit der klinischen Embryologen aber dazu, die COC zeitnah zur ICSI zu manipulieren.
Empfehlung
Unabhängig von der Herkunft der Spermien bleibt aber die Tatsache, dass sowohl die IVF als auch die ICSI einem genauen Zeitplan folgen sollten, um Befruchtungs- und Schwangerschaftsraten zu optimieren.
Die meisten Institute praktizieren heutzutage die Eizellgewinnung (Kap. „Was ist ‚Sterilität‘ – eine Begriffsbestimmung“) 36 h nach Ovulationsinduktion. Die Punktion der Follikel erfolgt ausschließlich ultraschallgesteuert meist unter leichter Sedierung. Die so gewonnene Follikelflüssigkeit darf nicht oder nur minimal abkühlen, da sie die temperatursensiblen COC enthält.
Beurteilung der Cumulus-Eizell-Komplexe
Die COC (Abb. 1) werden in der Regel nach der Expansion der Corona radiata sowie der äußeren Cumuluszellschichten beurteilt, wobei eine expandierte und luteinisierte Cumuluszellmatrix eine reife Eizelle (Metaphase II) beherbergen soll, während dichter gepackte Cumuluszellen eine Unreife der assoziierten Oozyte andeuten (Veeck 1999). Kürzlich wurde gezeigt, dass eine exakte Bestimmung des Reifegrades einer Eizelle anhand des Erscheinungsbildes des entsprechenden COC kaum möglich ist (Rattanachaiyanont et al. 1999; Ebner et al. 2008).
Abb. 1
Oozyte inmitten der Cumulusmatrix. Deutlich zu sehen die eizellnahe Struktur der Corona radiata
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Häufig findet man in den COC auch kleinere Ansammlungen von Blut (Daya et al. 1990; Ebner et al. 2008). Dieses Phänomen könnte ein Zeichen von follikulärer Überreife sein (Daya et al. 1990) und lässt auf eine reduzierte Eizellqualität schließen (Ebner et al. 2008). Prinzipiell stellt sich die Frage, ob man diese Areale nicht mittels zweier Spritzennadeln mechanisch entfernen sollte? Für die ICSI mag dieser Aufwand vergebens sein, ist doch die Oozyte bereits a priori geschädigt, doch für eine konventionelle IVF würde man sich einer potenziellen Quelle von Sauerstoffradikalen entledigen.
Bis zur Eizellgewinnung ist das Prozedere für jede Patientin mehr oder weniger ident, mit individuellen Abweichungen, was das jeweilige Stimulationsschema betrifft (Kap. „Ovarielle Stimulation: Begriffsbestimmung und Wirkweise“).
Sobald die COC aber im Labor gelandet sind, muss anhand der Samenqualität des Partners entschieden werden, ob eine konventionelle IVF möglich ist, oder ob eine ICSI (Abb. 2) als einzige Alternative für eine erfolgreiche Befruchtung verbleibt.
Abb. 2
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion mit deutlich sichtbarem Einstichtrichter. Das immobilisierte Spermium befindet sich noch in der ICSI-Pipette
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Im Zweifelsfall und v. a. bei Patienten mit schlechter Prognose sollte auf jeden Fall darauf geachtet werden, zumindest einen Teil der Oozytren mittels ICSI zu behandeln, um so ein totales Befruchtungsversagen bei der herkömmlichen IVF zu verhindern (Komsky-Elbaz et al. 2013).
Aufbereitung des Samens
Um die Qualität einer Samenprobe abschätzen zu können, muss das Ejakulat nach Verflüssigung nach WHO-Kriterien analysiert werden (Kap. „Andrologie in der interdisziplinären Reproduktionsmedizin“), es wird ein sogenanntes Spermiogramm erstellt (WHO 2010). Entsprechen Spermienanzahl, Beweglichkeit und Morphologie (Übersicht) den Referenzwerten (mitunter kann es in Einzelparametern auch leicht unter diesen Werten liegen), kann eine IVF ins Auge gefasst werden.
Letztendlich ist eine seriöse Entscheidung erst nach Aufbereitung des Ejakulats möglich.
WHO-Referenzwerte für ein Spermiogramm
Spermienanzahl: 15 × 106 pro ml bzw. 39 × 106 im Ejakulat
Beweglichkeit: 40 % motil bzw. 32 % progressiv motil
Morphologie: 4 % normale Formen
Jeglicher Aufbereitungstechnik zugrunde liegt das Bestreben, ein Maximum an gut beweglichen und normal geformten Spermien anzureichern. In der Regel geschieht das durch zweimaliges Abzentrifugieren des Ejakulates oder eines Ejakulat-Kulturmedium-Gemisches, wonach die beweglichen Spermien aus dem sich bildenden Pellet in den Überstand schwimmen. Wahlweise, für infektiöse Patienten hingegen ein absolutes Muss, kann das Ejakulat durch einen aus einer kolloidalen Suspension von Silikatpartikeln bestehenden Dichtegradienten zentrifugiert werden (Kap. „Inseminationsbehandlung“).
Da Zentrifugalkräfte mitunter für das Entstehen von DNA-Strangbrüchen in den Spermien verantwortlich sein können, kann alternativ auf Spermienselektoren zurückgegriffen werden, die problemlos ohne Zentrifugationsschritte funktionieren (Ebner et al. 2011a; Seiringer et al. 2013).
Nun gibt es aber auch Fälle ohne jegliche Spermien im Ejakulat, eine sogenannte Azoospermie. Hier besteht die Möglichkeit, aus dem Nebenhoden Spermien zu aspirieren. Dieser MESA genannte Eingriff bringt zahlenmäßig eine relative gute Ausbeute, allerdings lässt die Motilität oft zu wünschen übrig. Finden sich aber genug vitale Spermien im Aspirat, kann man die Spermiensuspension ebenso wie ein Ejakulat aufbereiten.
Trotzdem bleibt die MESA natürlich ein mikrochirurgischer Eingriff mit all seinen Komplikationen, weswegen heutzutage Spermien eher aus dem Hoden extrahiert werden. Bei einer solchen TESE werden kleinere Gewebsstücke entnommen und (meist) im Labor aufbereitet. Prinzipiell gilt es, die meist noch schlecht motilen Spermatozoen aus den Samenkanälchen zu gewinnen. Hierzu kann man entweder auf ein mechanisches Auspressen mittels steriler Werkzeuge zurückgreifen, was unter Kulturmedium erfolgen sollte, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern. Die so erhaltene mit unterscheidlichsten Zelltypen verunreinigte Spermiensuspension kann dann in ICSI-Schälchen eingebracht werden, wobei sich motile Spermien von den umgebenden Zellen quasi freischwimmen.
Eleganter – und auch mit einer besseren Ausbeute behaftet – ist die enzymatische Verdauung der Biopsate mit Kollagenase (GM501 Collagenase, Gynemed, Lensahn, Deutschland). Das sich dabei bildende Suspensat wird anschließend durch einen Dichtegradienten zentrifugiert, worauf sich die Spermien (motil und immotil) am Boden des Zentrifugenröhrchens ansammeln, um nach einem Waschschritt für die ICSI herangezogen zu werden (Wöber et al. 2015).
Es mehren sich die Stimmen, die selbst im Falle einer ausgeprägten Oligoasthenoteratozoospermie oder Kryptozoospermie eine TESE der Aufbereitung des suboptimalen Ejakulats vorziehen, weil die Samenqualität im Hoden oft besser ist als nach der Passage durch den Nebenhoden (Ollero et al. 2001; Greco et al. 2005).
In-vitro-Fertilisation
Die herkömmliche IVF ist im Wesentlichen den in vivo stattfindenden Prozessen nachempfunden, d. h. in einem Kulturschälchen werden (normalerweise 2–3 h nach Punktion) ein oder mehrere COC mit einer festgelegten Zahl an Spermien versetzt. In der Literatur findet man über die benötigte Spermienkonzentration unterschiedliche Angaben, meist trachteten die Autoren aber danach, pro Milliliter eine Endkonzentration von 50–150.000 Spermien (nach Aufbereitung des Ejakulates) zur Verfügung zu haben (Plachot et al. 2002; Tomsu et al. 2002; Hwang et al. 2005; Bungum et al. 2006). Natürlich muss man dann die Anzahl der zu inseminierenden COC pro Kulturschälchen so anpassen, dass zumindest 20–25.000 Spermien pro Eizelle garantiert sind. Arbeitet man unter Mikrotropfen, kann die Konzentration dementsprechend geringer gehalten werden, oft reichen hier 2–10.000 Spermien pro COC aus (Gianaroli et al. 1996).
Traditionellerweise werden die inseminierten COC über Nacht inkubiert, um am folgenden Tag mittels Pipetten derart denudiert zu werden, dass man das Vorhandensein von zwei Vorkernen bzw. zwei Polkörpern kontrollieren kann. Nun birgt diese Vorgangsweise aber ein erhöhtes Risiko, freie Sauerstoffradikale in der Kultur anzureichern (Bedaiwy et al. 2004).
Empfehlung
Um das Risiko einer Anreicherung freier Sauerstoffradikale in der Kultur zu umgehen, kann es ratsam sein, diese Inkubationsperiode auf 2 h zu verkürzen (Lundqvist et al. 2001; Kattera und Chen 2003).
Tatsächlich wurden so bei gleichbleibender Befruchtungsrate weniger Polyspermiefälle und bessere Embryoqualitäten beschrieben. Im Extremfall würden sogar 30 Sekunden Spermien-Ei-Interaktion ausreichen, ohne die weitere Entwicklung in vitro nachhaltig zu beeinträchtigen! (Bungum et al. 2006)
In ca. 5–10 % aller Fälle kann es zu einem völligen Befruchtungsversagen nach IVF kommen, jene Patienten, die ausschließlich polysperme Befruchtungen hatten, gar nicht mit eingerechnet. Oft sind hier immunologische, genetische oder eben doch andrologische Gründe ausschlaggebend.
Es empfiehlt sich wirklich, in Zweifelsfällen zumindest der Hälfte der Eizellen eine ICSI angedeihen zu lassen, um nicht vorzeitig den Zyklus abbrechen zu müssen.
In frühen Jahren wurde versucht, durch eine Verlängerung der Koinkubation von COC und Spermien oder durch eine deutlich höhere Konzentration an Spermien einem Befruchtungsversagen entgegenzuwirken, allerdings mit bescheidenem Erfolg (Gianaroli et al. 1996; Kastrop et al. 1999). Es scheint auch wenig zu fruchten, wenn man die Cumulusmatrix z. B. mittels zweier Kanülen mechanisch verkleinert oder der Kultur Hyaluronidase zugibt, um den Spermien enzymatisch den Zugang zur Eizelle zu erleichtern (Ebner et al. 2011b). Keine dieser Ansätze konnte ein kompletes Befruchtungsversagen verhindern, auch wenn letztere Methode bei jenen Patienten mit zumindest einer Zygote zu mehr Befruchtungen und Blastozysten führte.
Letztendlich kristallisiert sich einmal mehr heraus, dass nach einem Befruchtungsversagen nach IVF nur eine ICSI zielführend ist.
Denudation der Oozyten
Für eine erfolgreiche Fertilisation nach ICSI ist es unabdingbar, dass die Oozyte von den umgebenden somatischen Zellen befreit wird, weil man ja die Reife der zu injizierenden Gameten kontrollieren muss. Zudem würden überzählige Cumuluszellen die Manipulation mit der Haltepipette erschweren, wenn nicht unmöglich machen. Nicht zu vergessen das erhöhte Risiko, irrtümlich Fremd-DNA in die Oozyte einzubringen, wenn bei der Injektion erst eine Schicht Cumuluszellen passiert werden muss (Stanger et al. 2001).
Es hat sich im IVF-Labor bewährt, für den Denudationsschritt eine Kombination aus enzymatischer Verdauung und mechanischer Feinpräparation anzuwenden. Da die mechanische Manipulation (Abb. 3) gewisse Risiken birgt – so besteht die Gefahr, durch zu enge Pipetten den ersten Polkörper im perivittelinen Spalt zu dislozieren und somit den exakten Marker für die Teilungsspindel zu verlieren –, empfiehlt es sich, die vorherige Inkubation in dem Enzym Hyaluronidase entsprechend länger durchzuführen. Da alle kommerziell erhältlichen Produkte eine maximale Konzentration von 80 IU/l enthalten, was bestenfalls ein Zehntel des kritischen Schwellenwertes ausmacht, über dem eine parthenogenetische Aktivierung der Eizelle beobachtet worden ist (Van de Velde et al. 1997), kann der enzymatische Part auch mal bis zu 3 min in Anspruch nehmen (Moura et al. 2017).
Abb. 3
Mechanische Denudation eines Cumulus-Eizell-Komplexes mittels handgezogener Glaspipette. (Mit freundlicher Genehmigung der Firma Gynemed)
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Hat man bezüglich der Quelle von Hyaluronidase (unberechtigte) Sicherheitsbedenken, kann man alternativ auf rekombinante (Evison et al. 2009) oder pflanzliche (Parinaud et al. 1998) Produkte zurückgreifen (ICSI Cumulase, Origio, Måløv, Dänemark; CoronaseTM, Bio-Media, Boussens, Frankreich).
Im Zweifelsfall sollte man jedenfalls hartnäckige Cumuluszellen auf der Zona pellucida belassen (Abb. 4) und das Ganze als In-situ-Kokultur sehen (Ebner et al. 2006).
Abb. 4
Reife und morphologisch einwandfreie Metaphase-II-Eizelle mit unvollständig entfernten Cumuluszellen (4-Uhr-Position)
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Aufbereitung der Spermien
Selektion der Spermien
Der genauen Auswahl des Spermiums, welches für die ICSI herangezogen werden soll, kommt enorme Bedeutung zu (Kap. „Andrologie in der interdisziplinären Reproduktionsmedizin“). Nicht nur, dass der klinische Embryologe größtmögliche Sorgfalt bei der morphologischen Beurteilung des männlichen Gameten (nicht unter × 400) walten lassen sollte, darf man auch physiologische Gesichtspunkte nicht außer Acht lassen (Ebner et al. 2011c).
Eine Zeit lang wurde diesbezüglich eine IMSI genannte Methode sehr propagiert (Bartoov et al. 2003) und dies mag auch bei gewissen Konstellationen eine wertvolle Alternative sein, jedoch zeigten neuere Arbeiten, dass die unter 6500-facher Vergrößerung entdeckten Vakuolen erstens relativ häufig sind und zweitens eher einer Einbuchtung der Spermienmembranoberfläche entsprechen, als dass es sich um „Hohlräume“ im Spermienkopf handeln würde (Boitrelle et al. 2011, 2013).
Huszar et al. (2007) berichteten von Hyaluronatrezeptoren, die nach erfolgter Maturation am Spermienkopf exprimiert werden. Dies führte zur Entwicklung von mit Hyaluronsäure beschichteten Kulturschälchen (pICSI-Schälchen), die sich gut als physiologische Spermienselektoren eignen. Derselbe Effekt, also das Binden ausgereifter Spermien an Hyaluronat, lässt sich kostengünstiger mit hyaluronsäurehaltigen Medien (SpermSlow, Origio, Måløv, Dänemark; SpermCatch, Nidacon, Mölndal, Schweden) erzielen (Van den Bergh et al. 2009; Parmegiani et al. 2010a). Derart isolierte Spermien weisen offensichtlich weniger Strangbrüche bzw. eine reduzierte Aneuploidierate auf. Noch physiologischer ist sicherlich die Verwendung der Zona pellucida als Attraktion für reife Spermien, da dieses Modell mehr oder weniger der In-vivo-Situation entspricht.
Zu guter Letzt erlauben spezielle Kammern, die ausschließlich schnell vorwärts bewegliche Spermien selektionieren, die exklusive Akkumulation von DNA-intakten Spermatozoen. Die in solchen Selektoren außen vor bleibenden langsamen Spermien weisen offensichtlich nicht nur eine defekte Kern-DNA auf, sondern auch eine beeinträchtigte mitochondriale DNA, was zu ATP-Einbußen und mangelnder Motilität führt (Ebner et al. 2011a; Seiringer et al. 2013).
Manipulation der Spermien
Da in den meisten Fällen zumindest einige gut bewegliche Spermien nach Präparation des Ejakulates zur Verfügung stehen werden, stellt sich zuallererst das Problem des Einfangens der männlichen Gameten. Dieser Schritt kann in zwei verschiedenen Milieus durchgeführt werden (sieht man von herkömmlichem Kulturmedium ab). In der Regel wird zur Erleichterung dieses Prozesses Polyvinylpyrrolidon (PVP) verwendet, eine hochvisköse Substanz, die die Motilität der Spermien stark einschränkt. Gleichzeitig überzieht PVP die Innenseite der Einstichpipette, was der Präzision des Anstichprozesses sehr entgegenkommt. Besagtes Synthetikum verbleibt jedoch aufgrund seiner enormen Molekülgröße nach Injektion in der Eizelle, was mitunter zu einer Vakuolisierung der Zygote führt (Ebner et al. 2004). Nicht zuletzt deshalb war die Industrie seit längerer Zeit auf der Suche nach physiologischeren Ersatzprodukten und wurde bei Hyaluronsäure fündig (Barak et al. 1999; Balaban et al. 2003). Da dieses Glykosaminoglykan ein wesentlicher Bestandteil der Cumulusmatrix ist und zudem eine enorme Hydrationskapazität aufweist, lassen sich physiologische Lösungen unterschiedlicher Viskosität herstellen, die bereits mit Erfolg im IVF eingesetzt werden (Parmegiani et al. 2010b), auch wenn die Viskosität (und somit die Qualität) von PVP nie erreicht werden kann.
Ist das Spermium einmal eingefangen, stellt sich das Problem der Immobilisierung des männlichen Gameten. Dies ist erforderlich (Van den Bergh et al. 1995), um einerseits dem natürlichen Befruchtungsprozess zu entsprechen – einmal im Ei ist die Spermiengeißel unbeweglich –, aber auch um dem Spermienenzym Phospholipase C zeta (PLC ζ) Zutritt zur Eizelle zu ermöglichen, was in weiterer Folge die für die Eizellaktivierung und -befruchtung nötigen Kalziumoszillationen bedingt.
Herkömmlicherweise werden die für die ICSI herangezogenen Spermien mechanisch immobilisiert, entweder durch Pressen der Geißel gegen den Pipettenboden oder durch wiederholtes Aspirieren in der Gegend des Spermienmittelstücks, wobei letztere Methode zu deutlich schlechteren Befruchtungsraten führt (Van den Bergh et al. 1995).
Eine wesentlich elegantere Immobilisationstechnik, die zudem unabhängig von der Viskosität des verwendeten Mediums ist, wurde von Montag et al. (2000) beschrieben. Diese Autoren benutzten einen Diodenlaser (1,48 μm), um die Spermienmembran zu permeabilisieren. Um beim Einsatz am Menschen die Energiebelastung für die Spermien zu minimieren, wird in der Regel auf eine Zweischussstrategie, also das sukzessive Setzen zweier Laserpulse niedriger Energie (1,5 und 1,0 mJ), zurückgegriffen (Ebner et al. 2001, 2002). Einige wenige Arbeitsgruppen greifen auf eine piezoelektrische Manipulation motiler Spermien zurück, was wohl zu einer rascheren Ausschüttung von Kalzium in der Eizelle führt (Yanagida et al. 1999).
Ganz anders stellt sich die Sachlage dar, wenn man es ausschließlich mit immotilen Spermien zu tun hat. Hier steht man dem Problem gegenüber, zwischen unbeweglichen (aber befruchtungsfähigen) und nicht vitalen Spermien unterscheiden zu müssen, um zumindest einige wenige Befruchtungen zu erzielen. Häufige Praktiken in solchen Fällen sind die Verwendung hyperosmotischer Medien, um die osmotische Aktivität der Spermienmembran nachzuweisen (Casper et al. 1996; Liu et al. 1997) bzw. das mechanische Testen der Geißelelastizität mittels ICSI-Pipette (de Oliveira et al. 2004). Weiters wurde gezeigt, dass auch ein Diodenlaser für diese Zwecke herangezogen werden kann, denn vitale Spermien scheinen nach Laserbeschuss mit einem „Einrollen“ des Geißelendes zu reagieren (Aktan et al. 2004). Mittlerweile gibt es kommerziell erhältliche Phosphodiesterasehemmer, z. B. Theophyllin (GM501 SpermMobil, Gynemed, Lensahn, Deutschland), die durch Akkumulation von ATP im Spermium relativ unkompliziert einer stark eingeschränkten Spermienmotilität entgegenwirken (Ebner et al. 2011d).
ICSI
Unabhängig von der Tatsache, ob man ein motiles oder immotiles Spermium für die Injektion zur Verfügung hat, sollte die ICSI standardisierten Abläufen folgen (Übersicht).
Durchführung der ICSI
Es hat sich eingebürgert, dass die Eizelle an der 9-Uhr-Position mittels einer Haltepipette fixiert wird. Der erste Polkörper würde sich demnach in 6- oder 12-Uhr-Lage befinden.
Die Injektionspipette wird in der Folge vorsichtig an der 3-Uhr-Position gegen das Oolemma, also die Eimembran, gedrückt, um sich zu vergewissern, dass sich der sogenannte „Einstichtrichter“ bildet, welcher die Äquatorialebene anzeigt.
Nach erfolgter Penetration an eben jener Stelle empfiehlt es sich ein wenig Ooplasma zu aspirieren, um sicherzustellen, dass das Spermium auch in der Eizelle deponiert wird und nicht irrtümlich im perivitellinen Spalt (Vanderzwalmen et al. 1996).
Es zeigte sich in einer rezenten Studie (Krause et al. 2016), dass die Ausprägung des Einstichtrichters nicht nur von der Reife des jeweiligen Eies abhängt, sondern auch von der ovariellen Hyperstimulation.
Der Ansatz, den ersten Polkörper möglichst weit von der Einstichstelle entfernt zu positionieren, beruht auf der biologischen Tatsache, dass die Teilungsspindel diesem Polkörper gegenüberliegt. So meinte man, diesen sensitiven Mikrotubuliapparat vor mechanischen Schäden bewahren zu können (Nagy et al. 1995). Mittlerweile weiß man aber, dass einerseits die Spindel in der Eizelle relativ geschützt ist, und andererseits, dass sich die meiotische Spindel der Eizelle aufgrund der ovariellen Hyperstimulation bzw. der exzessiven Manipulation in vitro bei weitem nicht immer an der vermuteten Position befindet (Abb. 5).
Abb. 5
Schematische Darstellung einer Eizelle mit dem ersten Polkörper (1. PK) in 6-Uhr-Position. In Klammern der Prozentsatz an in vivo gereiften meiotischen Spindeln, die in der jeweiligen Zone nachgewiesen wurden. (Nach Hardarson et al. 2000)
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Dies erklärt wohl auch das Phänomen, dass unabhängig von der Lage des ersten Polkörpers während der ICSI idente Befruchtungsraten und Embryoqualitäten erzielt werden konnten (Blake et al. 2000).
Lediglich eine Ablage des Spermiums in unmittelbarer Nähe der vermuteten Spindel führte zu erhöhten Raten meiotischer Nondisjunction oder zu Zygoten (schlechter Prognose) mit randständigen Pronuklei.
ICSI-Versagen
Da ICSI eine relativ invasive Mikromanipulationstechnik ist, verwundert es nicht, dass Oozyten nach erfolgter Injektion lysieren können und somit unwiderruflich geschädigt sind. Allerdings sollte die Rate an degenerierten Eizellen in guten Labors 1–3 % nicht überschreiten. Besonders bei Patienten mit einigen wenigen Eizellen sollte sichergestellt werden, dass man keinen Schaden setzt, weil sonst natürlich die Gefahr droht, den ganzen Behandlungszyklus vorzeitig beenden zu müssen.
Eine Möglichkeit, den Injektionsprozess schonender zu gestalten, ist das Einsetzen eines Laserpulses, um die Zona pellucida an der geplanten Einstichstelle teilweise abzutragen und somit empfänglicher für die ICSI-Pipette zu machen (Rienzi et al. 2001; Nagy et al. 2002; Abdelmassih et al. 2002). Da diese Ablation an der Eizelle auf einige wenige Mikrometer (5–10 μm) beschränkt ist, ergibt sich in späteren Entwicklungsstadien (mit dünnerer Zona) das Problem, dass diese partielle Öffnung unauffindbar bleibt und somit eine assistierte Schlüpfhilfe („Assisted Hatching“) unterbleiben muss, da zwei artifizielle Öffnungen dem Schlüpfen abträglich sind, ja sogar zu nekrotischen Prozessen führen können.
Empfehlung
Diesem Problem kann insofern entgegengewirkt werden, indem man von Haus aus ein großflächigeres Abtragen der äußeren Hülle durchführt (Moser et al. 2004). Mit dieser Methode kann man zwei Vorteile vereinen: eine erhöhte Überlebensrate nach ICSI sowie eine verbesserte Hatching-Rate.
Gleichwohl wird es immer wieder Fälle geben, wo keine Eizellen degenerieren und es trotz ausreichender Eizellanzahl zu einem völligen Befruchtungsversagen nach ICSI kommt. Was also tun, wenn der Patient erneut in der Klinik vorspricht? Ein erneutes ICSI mag mitunter Erfolg bringen (Moomjy et al. 1998), kann aber getrost als suboptimale Therapie angesehen werden.
Viel erfolgversprechender scheinen hier verschiedene modifizierte ICSI-Techniken zu sein. So ermöglicht eine wiederholte Dislokation von Ooplasma innerhalb der Eizelle Befruchtungen unabhängig von der Tatsache, ob das frühere Befruchtungsdilemma auf den männlichen oder den weiblichen Gameten zurückzuführen war (Tesarik et al. 2002). Erklärt wird dieser Erfolg mit dem Leeren intrazellulärer Kalziumspeicher. Etwas schonender und mit einer viel geringeren Degenerationsrate einhergehend ist eine mICSI genannte Technik, die danach trachtet, stoffwechselaktive Mitochondrien aus der Peripherie im Zentrum des Ooplasmas (dem Ort der Befruchtung) zu akkumulieren (Ebner et al. 2004).
Eine artifizielle Aktivierung der Eizelle kann aber auch piezoelektrisch erfolgen (Baltaci et al. 2010). Dieser Ansatz hat mit den beiden weiter oben erwähnten Techniken gemein, dass diese mehr oder weniger invasive Eingriffe sind und/oder eine gewisse technische Fähigkeit des klinischen Embryologen voraussetzen. Viel eher ist man also dazu geneigt, eizellaktivierende Substanzen zu applizieren, allen voran den Ca2+-Ionophor A23187 (GM508 Gynemed, Lensahn, Deutschland), welche den Pegel an intrazellulärem Kalzium künstlich hochhalten (Rybouchkin et al. 1997), auch wenn es dabei nicht zu den charakteristischen Ca2+-Oszillationen kommt. Bei dieser Herangehensweise kommt es aufgrund des Öffnens von Membrankanälen oder eines aktiven Entleerens intrazellulärer Speicher zu einem intrazellulären Kalziumanstieg, der nach Erreichen eines „Schwellenwertes“ zur Eizellaktivierung führt. Durch ein einfaches 15-minütiges Bad in A23187 können so in diesem schwierigsten Kollektiv Befruchtungsraten von um die 50 % erzielt werden (Montag et al. 2012; Ebner et al. 2015). Alternativ kann auf eine selbst fabrizierte Ionomycinlösung (Nikiforaki et al. 2016) oder Strontiumchlorid (Kim et al. 2014) zurückgegriffen werden, um Eizellen künstlich zu aktivieren. Die physiologischste Methode hinsichtlich des Auftretens von Oszillationen wäre sicherlich die Verwendung von rekombinanter PLC ζ. Erste Erfolge im Tiermodell wurden bereits publiziert (Swann et al. 2012; Yoon et al. 2012).
Post-IVF/ICSI-Prozesse
Durch eine optimierte Präparation und Auswahl der Spermien bzw. die Anwendung der richtigen Methode (z. B. besser im Zweifelsfall immer einen Teil der Oozyten einer ICSI zuführen), sollten in 60 % (IVF) bis 80 % (ICSI) der Eizellen eine Befruchtung erfolgt sein (Kap. „Physiologie der Befruchtung“). Diese Raten würden eben publizierten „Key Performance Indikatoren“ entsprechen (ESHRE und Alpha 2017). Nun gilt es, während der kommenden Tage in Kultur die positiven und negativen Prädiktoren (Kap. „Bewertung der Qualität menschlicher Oozyten und Embryonen“) richtig zu deuten, um letztendlich den oder die besten Kandidaten hinsichtlich einer erfolgreichen Implantation (Kap. „Endometrium und Embryo – Interaktion“) herauszufiltern.
Überzählige vitale Embryonen/Blastozysten werden zur Erhöhung der kumulativen Schwangerschaftsrate standardmäßig eingefroren bzw. vitrifiziert (Kap. „Kryokonservierung“).
Optional können weitere Mikromanipulationstechniken eingesetzt werden, um die Implantationsrate zu erhöhen, vor allem einer als „Assisted Hatching“ bekannten Technik wird ein gewisses Potenzial zugesprochen (Kap. „Assisted Hatching“). Wie der Name schon sagt, soll bei entsprechender Indikation (z. B. mehrere Fehlversuche) den Embryonen das Verlassen aus der möglicherweise durch die Langzeitkultur gehärteten Zona pellucida erleichtert werden (Primi et al. 2004).
Das individuelle In-vitro-Wachstum sowie die Fähigkeit, spontan die äußere Glykoproteinmatrix zu verlassen, lassen jedoch keinen Rückschluss auf die genetische Konstitution des Embryos zu. Hier bleibt nur die Biopsie des Embryos mit anschließender präimplantationsgenetischer Untersuchung (Kap. „Polkörper- und Präimplantationsdiagnostik“), um zu garantieren, dass ein euploider Embryo für den Embryotransfer (Kap. „Embryonentransfer“) zur Verfügung steht. Oft endet eine solche invasive genetische Technik aber mit dem Absetzen des Behandlungszyklus, weil alle untersuchten Eizellen oder Embryonen aneuploid sind. Hier erreichen die assistierten Reproduktionstechniken dann ihre Grenzen, zumindest was die Verwendung homologer Eizellen betrifft.
Literatur
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