Karyometrie BBN-induzierter Präkanzerosen des Urothels

Im Tierversuch diente das durch N‑Butyl-N-(4-Hydroxybutyl)nitrosamin (BBN) induzierte Karzinom der Harnblase häufig als Modell zur Untersuchung der Kanzerogenese oder zu Therapieversuchen [19, 23].

N-[4-(5-nitro-2-furyl)-2-thiazolyl]formamid (FANFT) und N‑Methyl-N-Nitrosoharnstoff (MNU) wurden gleichfalls als Karzinogene verwandt. Als Folge der Kanzerogenexposition wurde zunächst eine Hyperplasie des Urothels beschrieben [1, 2, 4‐6, 8‐12, 14‐16, 18, 22, 23]. Ferner wurden papilläre oder noduläre Hyperplasien und Papillome beobachtet [2, 4‐6, 8, 15, 18, 22, 23]. Schichtungs- und Reifungsstörungen des Urothels wurden als leichte, mittelschwere oder schwere Hyperplasie oder auch als Dysplasie und schließlich als Carcinoma in situ bezeichnet [4‐6, 8, 9, 12, 14‐16, 22, 23]. Die Diagnosen basierten auf keiner verbindlichen Klassifikation.

Ziel dieser Arbeit war, die BBN-induzierten morphologischen Veränderungen des Urothels auf der Grundlage karyometrischer Maße an Ausstrichpräparaten als Basis weitergehender Untersuchungen objektiv darzustellen.

Präkanzerosen des Urothels der Harnblasen von 60 weiblichen Wistar-Ratten (Landeszuchtanstalt Hannover) wurden durch N‑Butyl-N-(4-Hydroxybutyl)nitrosamin (BBN; Prof. Dr. R. Preussmann, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg) in 0,05 Vol.-%iger Lösung als Trinkwasser induziert. Jeweils 3 Tiere wurden in einem Makrolonkäfig (Ehret, Emmendingen) gehalten. Das Gewicht betrug zu Versuchsbeginn 180–200 g. Standardfutter (Eggersmann, Rinteln) und BBN-Lösung wurden ad libitum verfüttert. Die Raumtemperatur betrug 22 °C, die relative Luftfeuchtigkeit 55 %, der Hell-Dunkel-Rhythmus 12 h. 6 Kontrolltiere tranken Leitungswasser. Nach einer BBN-Gabe von 2–20 Wochen, jeweils gefolgt von einem 2‑wöchigen BBN-freien Intervall, wurden 2‑wöchentlich 6 Tiere in Äthernarkose durch intraperitoneal in Überdosierung appliziertes Nembutal (Abbott, Ludwigshafen) getötet. Bei 3 Tieren wurde das Urothel von der Lamina propria abgelöst und auf Objektträgern ausgestrichen. Die Ausstriche wurden mit Merckofix-Spray (Merck, Darmstadt) fixiert und nach Papanicolaou gefärbt. Für die vergleichende histologische Untersuchung wurden 3 Tiere mit einer gepufferten Formalin-Glutaraldehyd-Lösung perfusionsfixiert. Die zytologischen Präparate wurden mit 1000facher Vergrößerung fotografiert. Auf Papierabzügen mit der Endvergrößerung × 2100 wurden die Zellkerne mit einem Cursor umfahren. Von den Kontrollen und 2‑Wochen-Gruppen wurden 300–600 Kerne ausgemessen. Das Messsystem MOP-AMO2 (Kontron, Eching) war an den Rechner HP 9825A (Hewlett-Packard, Böblingen) angeschlossen, der Umfang, Fläche, maximalen Durchmesser, Halbachsenrelation und Formfaktor sowie die jeweiligen Maximal- und Minimalwerte, Durchschnitt und Standardabweichung ausgab. Die ermittelten Maße wurden in 8–10 Klassen unterteilt und im χ²-Test geprüft.

Die Karyometrie wurde zur Objektivierung des Malignitätsgrades von Harnblasentumoren bereits 1922 eingeführt [21]. Spätere Untersuchungen ergaben eine gute Korrelation zwischen der morphometrischen und der histologischen Klassifikation von klinischen Blasentumoren [3, 7, 17]. In der Literatur fanden sich keine karyometrischen Untersuchungen experimenteller Harnblasentumoren oder ihrer Vorstadien.

Ziel dieser Arbeit war, die BBN-induzierten morphologischen Veränderungen des Urothels auf der Grundlage karyometrischer Maße an Ausstrichpräparaten objektiv zu beschreiben.

Leichtgradige zytologische Veränderungen des Urothels waren in dem hier vorgestellten Experiment bereits nach einer 2‑wöchigen BBN-Exposition festzustellen, die mit einer signifikanten Änderung der Kernflächenverteilung einhergingen. Kernunregelmäßigkeit und die Verschiebung zu den Klassen mit größerer Kernfläche nahmen nach 4 Wochen BBN signifikant zu. Nach 6 Wochen BBN bestand histologisch bereits eine fokale Schichtungsstörung des Urothels, während sich die Kernflächen von den Klasse 6–8 zu Klassen 3 und 4, möglicherweise als Folge der Reifungsstörung des Urothels, verkleinerten. Insgesamt kam es im Verlauf von 14 Wochen jedoch zu einer signifikanten Zunahme der größeren Kernflächen, während sich zytologisch eine deutliche Anisokaryose entwickelte.

Eine Reifungsstörung des Epithels im Sinne einer Dysplasie war somit bereits nach einer 4‑wöchigen, deutlicher nach einer 6‑wöchigen BBN-Exposition anzunehmen, die zytologisch und karyometrisch im Verlauf des Experiments an Schweregrad zunahm.

Die formale Pathogenese des experimentellen Harnblasenkarzinoms wurde in der Literatur unterschiedlich beschrieben. Wie in der vorgelegten Arbeit wurde vielfach BBN in 0,05 %iger Lösung als Kanzerogen im Trinkwasser verfüttert [1, 2, 6, 9, 10, 12, 14‐16, 18, 23]. Andere Arbeitsgruppen setzten FANFT [4, 22] oder MNU [8] ein. Als erste Reaktion fanden die Autoren eine Hyperplasie des Urothels [1, 2, 4, 6, 8‐10, 12, 14‐16, 18, 22, 23], in der Schichtungs- und Reifungsstörungen auftreten konnten [6, 8, 9, 12, 14, 15, 22] und die als leichte, mittelschwere oder schwere Hyperplasie [4] beurteilt wurden. Die Veränderungen wurden auch als Dysplasie [14, 16] und schließlich als Carcinoma in situ aufgefasst [8, 23]. In späteren Stadien traten noduläre oder papilläre Hyperplasien und Papillome mit oder ohne Atypien als Vorläufer von Karzinomen auf [1, 4, 6, 8, 10, 12, 14‐16, 18, 22, 23].

Das durch BBN induzierte Spektrum der Neoplasien schien einigen Autoren identisch mit dem der menschlichen Harnblase zu sein [15, 18, 23]. Wenige Arbeiten legten das Augenmerk auf zytologische Veränderungen des Urothels [8, 12, 14]. Unter Berücksichtigung der Expositionsdauer ergab sich ein erheblicher Unterschied zwischen den früheren und den hier vorgelegten Ergebnissen. So wurden nach 20 oder 40 Wochen BBN Hyperplasie, Papillome und Karzinome, jedoch keine Dysplasie beschrieben [1, 10], nach 8 oder 20 Wochen eine fokale Hyperplasie [2, 9], Hyperplasie und Papillome nach 6 Wochen ohne und nach 12 Wochen mit fokaler Atypie [12].

Die Vielfalt und mangelnde Vergleichbarkeit der Diagnosen beruhte hauptsächlich auf dem Fehlen einer verbindlichen Klassifikation. Selbst in der Klinik bezeichneten die unterschiedlichen Begriffe wie dysplastische intraepitheliale Läsion, Dysplasie, Atypie, einfache und atypische Hyperplasie, Carcinoma in situ G1 und intraepitheliale Neoplasie dieselbe Urothelveränderung mit unklarer Prognose, die bei Tumorpatienten als Risikofaktor für ein Rezidiv aufgefasst wird [13]. Die WHO-Klassifikation trennt die urotheliale Hyperplasie von der Dysplasie. Die Hyperplasie weist keine zytologische Atypie und kein prämalignes Potential auf. Die Dysplasie zeigt zytologische und architektonische Veränderungen, die geringer ausgeprägt sind als die des Carcinoma in situ. Primäre Dysplasien sollen in seltenen Fällen zu Blasentumoren fortschreiten [20]. Über die morphologische Analogie hinaus sind Klinik und Experiment offensichtlich durch grundlegend unterschiedliche Konzepte getrennt. Selbst auf der Grundlage der WHO-Klassifikation waren Hyperplasie und Dysplasie in der Frühphase des vorliegenden Experiments morphologisch nicht zweifelsfrei zu trennen.

Erste Veränderungen des Urothels, die histologisch als Hyperplasie zu deuten waren, traten in Woche 2 auf. Ab Woche 4 kam es zu Kernvergrößerungen, die in Woche 6 histologisch von einer Schichtungsstörung des Urothels begleitet wurden. Die Karyometrie stützte diese morphologischen Beobachtungen signifikant. Berücksichtigte man die bereits in Woche 4 aufgetretenen, morphologisch und morphometrisch fassbaren Veränderungen, waren diese frühen Alterationen des Urothels bereits als leichtgradige Dysplasie anzusehen.

Das hier vorgestellte Versuchsmodell wurde in den letzten Jahren zu genetischen und molekularpathologischen Untersuchungen herangezogen. So wurden p53- und H‑ras-Mutationen, erhöhte Werte des „epidermal growth factor receptor“ (EGFR) und Allelenverlust wie bei klinischen Tumoren und auch chromosomale Alterationen in frühen, nicht-invasiven Stadien beschrieben [23].