Kompendium Internistische Onkologie

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Publiziert am: 18.11.2022

Marker für minimale Resterkrankung: Minimal Residual Disease

Verfasst von: Monika Brüggemann, Christiane Pott, Thomas Stübig, Michael Kneba und Andreas Hochhaus

In den letzten Jahren wurden wesentliche Fortschritte im biologischen Verständnis und der Therapie von hämatologischen Neoplasien und soliden Tumoren erzielt. Durch den Einsatz innovativer Therapiekonzepte erreichen mittlerweile viele Patienten komplette Remissionen ihrer Erkrankung. Dennoch verbleiben auch in der Phase der klinischen Remission oftmals residuelle Tumorzellen im Körper des Patienten, die die sogenannte „minimal residual disease“ (MRD) ausmachen und den Ausgangspunkt für ein klinisches Rezidiv darstellen. Deshalb hat die MRD-Quantifizierung im Therapieverlauf vor allem bei hämatologischen Neoplasien eine erhebliche prognostische Bedeutung gewonnen und Eingang in die Therapiestratifikation insbesondere bei der ALL, AML und CML gefunden. Bei soliden Tumoren beschränken sich die meisten Studien auf den Nachweis und die Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen bzw. zirkulierender Tumor-DNA/-RNA bei Diagnosestellung oder im Rezidiv. Allerdings zeigt sich zunehmend, dass auch für diese Tumorerkrankungen eine Charakterisierung persistierender Tumorzellen in der Phase der klinischen Remission relevante Einblicke in die Biologie der Erkrankung und des metastatischen Prozesses sowie die Prognose des Patienten erlaubt.

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Grundlagen und Problemstellung
Methoden zum MRD-Nachweis
Klinische Bedeutung
Schlussfolgerung und Ausblick

Grundlagen und Problemstellung

In den letzten Jahren wurden wesentliche Fortschritte im biologischen Verständnis und der Therapie von hämatologischen Neoplasien und soliden Tumoren erzielt. Durch den Einsatz innovativer Therapiekonzepte erreichen mittlerweile viele Patienten komplette Remissionen ihrer Erkrankung. Dennoch verbleiben auch in der Phase der klinischen Remission oftmals residuelle Tumorzellen im Körper des Patienten, die die sogenannte „minimal residual disease“ (MRD) ausmachen und den Ausgangspunkt für ein klinisches Rezidiv darstellen. Deshalb hat die MRD-Quantifizierung im Therapieverlauf vor allem bei hämatologischen Neoplasien eine erhebliche prognostische Bedeutung gewonnen und Eingang in die Therapiestratifikation insbesondere bei der akuten lymphatischen Leukämie (ALL), akuten myeloischen Leukämie (AML) und chronischen myeloischen Leukämie (CML) gefunden. Bei soliden Tumoren beschränken sich die meisten Studien auf den Nachweis und die Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen (siehe Kap. „Zirkulierende Tumorzellen“) bzw. zirkulierender Tumor-DNA/-RNA bei Diagnosestellung oder im Rezidiv. Allerdings zeigt sich zunehmend, dass auch für diese Tumorerkrankungen eine Charakterisierung persistierender Tumorzellen in der Phase der klinischen Remission relevante Einblicke in die Biologie der Erkrankung und des metastatischen Prozesses sowie die Prognose des Patienten erlaubt.

Bei Diagnosestellung tragen Patienten mit Leukämien, Lymphomen oder soliden Tumoren eine Gesamtzahl maligner Zellen von 10¹⁰–10¹², was einer Tumorzellmasse von ca. 10 g bis 1 kg entspricht. Die Qualität einer nach Therapie erreichten Remission wird in der Praxis durch die klinische Untersuchung, bildgebende Verfahren und morphologisch-mikroskopische Untersuchung von Gewebebiopsaten, Knochenmarkaspiraten oder peripherem Blut dokumentiert. Die dabei erzielte untere Nachweisgrenze für residuelle Tumorzellen liegt bei 1–5 %, bezogen auf die Gesamtzahl der analysierten Zellen, sodass bis zu etwa 10⁸–10¹⁰ residuelle Tumorzellen dem Nachweis entgehen können (Abb. 1). Eine sensitivere Erfassung der Resttumorlast soll prognostische Aussagen ermöglichen, da sie die Chemosensitivität der Erkrankung und damit die Effektivität der applizierten Therapie reflektiert.

Die klinische Relevanz einer sensitiven MRD-Messung ist allerdings für unterschiedliche Tumorentitäten verschieden und bisher vornehmlich für hämatologische Erkrankungen etabliert. Ein wesentlicher Grund hierfür ist die Möglichkeit der wenig invasiven Gewinnung von repräsentativem Material über eine Knochenmarkaspiration bzw. eine Blutanalyse. Für solide Tumoren sind sequenzielle Biopsien vom Ort der Tumorentstehung nicht möglich. Hier hat sich erst in den letzten Jahren mit der Verfügbarkeit von Hochdurchsatztechnologien der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen bzw. zellfreier DNA/RNA im Blutplasma als Möglichkeit etabliert, im Therapieverlauf MRD repräsentativ zu messen. Insbesondere bei der ALL und der AML wird die frühe MRD-Messung genutzt, um Patienten mit MRD-Persistenz zu identifizieren, die möglicherweise Kandidaten für eine intensivierte oder modifizierte Therapie sind. Auch MRD-Messungen vor definierten Therapieelementen, wie z. B. der allogenen Stammzelltransplantation, können herangezogen werden, den Erfolg dieser Therapieelemente vorauszusagen. Spätere MRD-Messungen werden z. B. zur frühzeitigen Detektion eines drohenden Rezidivs genutzt. Bei der CML ist eine tiefe langfristige molekulare Remission Voraussetzung für einen Absetzversuch von Tyrosinkinase-Inhibitoren.

Methoden zum MRD-Nachweis

Typischerweise weisen MRD-Messmethoden Tumorzellen selbst bzw. Tumorzell-DNA oder -RNA nach. Andere Tumormarker, also Proteine, Peptide oder andere biologische Substanzen wie z. B. das Alpha-1-Fetoprotein, das prostataspezifische Antigen oder Thyreoglobulin, die weniger spezifisch mit einer Tumorerkrankung assoziiert sind und deren Kinetik ebenfalls der Verlaufskontrolle unter und nach Therapie dienen, werden in diesem Kapitel nicht besprochen (siehe hierzu Kap. „Tumormarker im Serum“).

Leukämie-, Lymphom- und Tumorzellen lassen sich von gesunden Zellen anhand morphologischer und zytochemischer Eigenschaften, dem Immunphänotyp, definierter genetischer Aberrationen oder im Fall von lymphatischen Neoplasien anhand ihrer Immungenumlagerungen unterscheiden. Zur MRD-Quantifizierung werden molekulare, (molekular)zytogenetische, durchflusszytometrische und immunzytochemische Verfahren herangezogen.

Immunzyotochemie

Die Immunzytochemie wird insbesondere bei soliden Tumoren zur MRD-Messung verwendet. Während sich in der konventionellen Histopathologie lediglich mikrometastatische Tumorzellaggregate nachweisen lassen, entziehen sich einzelne Karzinomzellen im Knochenmark weitgehend einer zytologisch eindeutigen Identifizierung, sodass spezifischere Färbungen erforderlich sind. Für immunzytochemische Verfahren ist die Wahl des Markerproteins von entscheidender Bedeutung.

Zytokeratine als integrale Bestandteile des Zytoskeletts epithelialer Zellen sind stabil exprimierte Merkmale in Tumorzellen, die mittels spezifischer monoklonaler Antikörper in einzelnen Karzinomzellen eindeutig nachweisbar sind. Oftmals geht der Detektion ein Anreicherungsschritt voraus. Über Unterschiede in Größe, Dichte oder Flexibilität oder mittels spezifischer Oberflächenantigene, meist EpCAM („epithelial cell adhesion molecule“) werden Tumorzellen von hämatopoetischen Zellen separiert. Die Methoden, die dem MRD-Nachweis bei soliden Tumoren dienen, gleichen dabei denen des Nachweises zirkulierender Tumorzellen bei Diagnosestellung und werden im Kap. „Zirkulierende Tumorzellen“ näher beschrieben.

(Molekular)Zytogenetik

Definierte genetische Aberrationen können im Therapieverlauf monitoriert werden. Die klassische Zytogenetik eignet sich weniger zum sensitiven MRD-Nachweis, da sie Metaphasenkerne benötigt, keine Quantifizierung erlaubt und in der Regel eine geringe Sensitivität aufweist. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zum Nachweis spezifischer Translokationen oder größerer Kopienzahlveränderungen ist auch an Interphasekernen möglich, allerdings ist auch hier die Sensitivität auf 1–5 % begrenzt.

Polymerasekettenreaktion (PCR) und Next Generation Sequencing (NGS)

Die derzeit sensitivste Methodik zur MRD-Quantifizierung v. a. bei hämatologischen Neoplasien ist der PCR-Nachweis spezifischer genetischer Zielstrukturen. Als Zielgene dienen Translokationen (z. B. BCR-ABL1), Deletionen (z. B. intragene IKZF1-Deletionen), Duplikationen (z. B. FLT3-interne Tandemduplikationen) oder Mutationen (z. B. NPM1-Mutationen). Für lymphatische Neoplasien sind klonale Immungenumlagerungen zusätzliche hochspezifische Marker.

Immunglobulin-(IG-) und T-Zell-Rezeptor-(TR-)Gene lagern sich früh in der lymphatischen Entwicklung auf DNA-Ebene um und stellen hochspezifische Sequenzabschnitte für die Codierung der hypervariablen Regionen der TR/IG dar. Sie eignen sich deshalb hervorragend, um die Klonalität einer lymphatischen Population zu beweisen. Die Sequenzinformation der hypervariablen Region stellt eine Art genetischen Fingerabdruck jeder lymphatischen Zelle dar und ermöglicht damit deren sensitiven Nachweis auch im MRD-Setting. Die genannten molekularen Marker werden zur MRD-Quantifizierung meist mittels quantitative Echtzeit-PCR („real-time quantitative PCR“, RQ-PCR) untersucht. IG/TR-Genumlagerungen und auch ein Teil der zuvor genannten genetischen Aberrationen können auf DNA-Ebene nachgewiesen werden. Insbesondere bei den Translokationen ist allerdings in der Regel eine Analyse auf Transkriptebene notwendig (z. B. BCR-ABL1), da die Bruchpunktregion oftmals zu groß für eine unmittelbare DNA-basierte Analyse ist. Als Primer dienen Konsensusoligonukleotide, z. T. aber auch mutationsspezifische Primer, um die Spezifität der Analyse zu erhöhen. In den letzten Jahren hat sich neben der RQ-PCR die „digital droplet PCR“ (ddPCR) etabliert, die eine absolute Quantifizierung ohne die Notwendigkeit einer parallelen Amplifikation einer Standardverdünnungsreihe ermöglicht.

Als weitere molekulare Hochdurchsatzmethodik wird zunehmend das Next Generation Sequencing (NGS) verfügbar. Entweder werden einzelne Aberrationen amplikonbasiert hochparallel sequenziert oder aber ganze Genpanel untersucht. Vorteil dieser Methode ist, dass verschiedene Aberrationen gleichzeitig analysiert werden können und die Notwendigkeit der Generierung patientenspezifischer Assays entfällt. Die Sensitivität der Methodik wird wesentlich bestimmt durch

die Menge der eingesetzten Zielkopien und
durch die Spezifität der Sequenzierung.

Die Sequenzierung unterliegt wesentlich dem Sequenzierfehler, der Mutationen vortäuschen kann. Weiterhin ist die bioinformatische Auswertung bisher unzureichend standardisiert. Außerdem ist die Wahl des richtigen Zielgens von entscheidender Bedeutung. So ist z. B. DNMT3 bei der AML oftmals präleukämisch mutiert, sodass entsprechende Aberrationen nicht nur im Bulk der Leukämie, sondern im Sinne einer klonalen Hämatopoese auch in Vorläuferzellen und nicht-leukämischen Zellen nachweisbar sind und auch in der Phase der MRD-Negativität persistieren können (Debarri et al. 2015). Hier ermöglicht eine MRD-Panelsequenzierung interessante Einblicke in Veränderungen der klonalen Komposition einer Neoplasie in der Phase der Remission.

Durchflusszytometrie

Die durchflusszytometrische MRD-Analyse detektiert residuelle Tumorzellen über den Nachweis tumorassoziierter Antigenexpressionsprofile. Auch hier ist die breiteste Anwendung der Methode bei hämatologischen Neoplasien, insbesondere bei akuten Leukämien, der CLL und dem Myelom.

Neben dem Ansatz, einen leukämieassoziierten Immunphänotyp bei Diagnosestellung zu charakterisieren und diesen im Therapieverlauf zu monitorieren, etabliert sich zunehmend der sogenannte „Different from normal“-Ansatz (Schuurhuis et al. 2018), bei dem nach Unterschieden zum normalen Ausreifungsprofil gesunder Vorläuferzellen gesucht wird. Der zweite Ansatz hat den Vorteil, nicht unbedingt eine diagnostische Probe zu benötigen und immunphänotypische Shifts zu detektieren. In innovativen Vielfarbpanels werden in der Regel beide Ansätze kombiniert. Die Sensitivität der Vielfarbdurchflusszytometrie wird wesentlich durch die Zahl der analysierten Zellen bestimmt.

Im Gegensatz zu molekularen Methoden, mit denen einzelne Tumorzellen nachgewiesen werden können, erfordert die durchflusszytometrische MRD-Messung einen Cluster von z. B. 50 Zellen mit einem charakteristischen Immunphänotyp (Brüggemann et al. 2010), sodass zum Erreichen der gleichen theoretischen Sensitivität ein Vielfaches an Zellmaterial gegenüber molekularen Methoden erforderlich ist.

Vorteil der Durchflusszytometrie gegenüber molekularen Methoden ist die Möglichkeit, residuelle Tumorzellen näher zu charakterisieren, um z. B. die Expression von therapeutischen Zielstrukturen zu bestimmen (z. B. CD20-, CD22- oder CD38-Expression). Allerdings sind keine retrospektiven Untersuchungen möglich, da nur intakte Zellen mit einer maximalen Transportzeit von 48–72 Stunden bearbeitet werden können. Ein weiteres Problem ist die Verwendung unterschiedlichster Panels und Färbeprotokolle, die die Vergleichbarkeit generierter Daten erheblich einschränken (Roschewski et al. 2014). Derzeit gibt es verschiedene Konsortien, die an einer Standardisierung der durchflusszytometrischen MRD-Diagnostik für verschiedene hämatologische Entitäten arbeiten (z. B. European LeukemiaNet und das EuroFlow-Konsortium; Schuurhuis et al. 2018; Theunissen et al. 2017).

Klinische Bedeutung

Leukämien

Die derzeit breiteste Anwendung hat die MRD-Diagnostik im Therapieverlauf für Leukämien, bei denen MRD im Knochenmark und/oder Blut gemessen werden kann.

Akute lymphatische Leukämie

Bei der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) erfolgt die MRD-Quantifizierung durchflusszytometrisch oder molekular. Als molekulare MRD-Marker dienen neben der BCR-ABL1-Translokation für Philadelphia-Chromosom-positive ALL insbesondere klonale IG/TR-Genumlagerungen, die mittels RQ-PCR quantifiziert werden. Die amplikonbasierte IG/TR-NGS-Analyse erlaubt prinzipiell eine MRD-Messung mit verbesserter Sensitivität und Spezifität, wird derzeit aber noch im Rahmen von Studien auf ihre Anwendbarkeit in der Routine getestet. Wie seit vielen Jahren für die Durchflusszytometrie und RQ-PCR (EuroFlow, I-BFM-FLOW-Netzwerk und EuroMRD) ist auch für die NGS-basierte MRD-Quantifizierung bei der ALL die Validierung und Standardisierung Gegenstand europäischer Netzwerke. Eine neue Herausforderung stellen klonale Selektions- und Evolutionsphänomene unter neuen zielgerichteten Therapien (z. B. CD19-Negativität nach CD19-Therapie) dar, die unter konventionellen Chemotherapien nicht/selten beobachtet werden und methodisch die MRD-Messung erschweren.

Die MRD nach Induktion/früher Konsolidierung hat sich für die ALL des Erwachsenen und des Kindes als wichtigster unabhängiger prognostischer Faktor herausgestellt (Berry et al. 2017). Patienten mit einer MRD-Persistenz auf einem Niveau von ≥10⁻⁴ zu diesem Zeitpunkt werden auch als MRD-Persister bezeichnet (Gökbuget et al. 2012) und führen in vielen Therapieprotokollen zur Einstufung in eine Hochrisikogruppe mit entsprechender Intensivierung der Therapie.

In vielen Therapieprotokollen zur ALL des Erwachsenen ist die MRD-Persistenz Indikation zur Stammzelltransplantation (SZT). Allerdings ist ein hohes MRD-Niveau vor SZT auch ein ungünstiger prognostischer Faktor (Bader et al. 2019), sodass im Rahmen der deutschen multizentrischen ALL-Studiengruppe derzeit getestet wird, ob eine MRD-Reduktion vor Transplantation die Prognose der Patienten bessert. Erste Daten deuten darauf hin, dass innovative Therapieelemente, wie z. B. Blinatumomab-Therapie, die Prognose MRD-positiver Patienten verbessern kann (Topp et al. 2012; Gökbuget et al. 2018). Umgekehrt identifiziert eine sehr frühe MRD-Negativität (unter Induktion I) Patienten mit einem sehr raschen MRD-Ansprechen und exzellenter Prognose (Brüggemann et al. 2006). Bei der ALL ist mittlerweile auch ein Postremissions-MRD-Monitoring zur frühzeitigen Detektion eines drohenden Rezidivs etabliert. Patienten mit Rekonversion zur quantifizierbaren MRD-Positivität weisen ein hohes Rezidivrisiko mit einer Wahrscheinlichkeit einer kontinuierlichen kompletten Remission über 5 Jahre von lediglich 21 % auf (Gökbuget et al. 2012).

Akute myeloische Leukämie

Die MRD-Messung bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) ist im Vergleich zur MRD-Analyse bei der ALL als methodisch herausfordernder anzusehen. Zum einen gibt es, anders als bei der ALL, keinen molekularen Marker, der eine MRD-Messung bei der Mehrheit der AML-Patienten erlaubt. Zum anderen besteht im Vergleich zur ALL eine deutliche größere Heterogenität des inter- und intraindividuellen Immunphänotyps mit z. T. erheblichen immunphänotypischen Shifts.

Durchflusszytometrisch wird eine MRD-Messung mit mindestens 8 Farben und die Analyse von mindestens 5–10 × 10⁵ Zellen empfohlen, um eine Sensitivität von mindestens 10^-3 zu gewährleisten (Schuurhuis et al. 2018). Die molekulare MRD-Analyse erlaubt oftmals eine sensitivere MRD-Detektion, allerdings sind geeignete Zielgene nur bei ca. 40 % der AML-Patienten nachweisbar.

Als MRD-Marker eignen sich neben den Fusionsgenen RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH11 und PML-RARA Vor allem NPM1-Mutationen, die mittel RQ-PCR bzw. ddPCR/NGS quantifiziert werden. Andere Mutationen wie DNMT3A, ASXL1 und TET2 sind nicht als sicher AML-repräsentativ anzusehen, da sie auch präleukämisch im Sinne einer klonalen Hämatopoese persistieren können. Im Rahmen einer Panel-NGS-Analyse kann eine Kombination unterschiedlicher Mutationen eine verbesserte MRD-Quantifizierung ermöglichen.

Die größte klinische Relevanz hat die MRD-Messung bei der AML derzeit für die akute promyelozytäre Leukämie (APL), für die mit dem Fusionstranskript PML-RARA ein valider und sensitiver MRD-Marker zur Verfügung steht. Hier zeigten verschiedene prospektive Studien, dass das Erreichen einer MRD-Negativität mit einem signifikant reduzierten Rezidivrisiko korreliert, während eine MRD-Persistenz nach Konsolidierung und das Wiederauftreten messbarer MRD eng mit einem hämatologischen Rezidiv assoziiert ist (Grimwade et al. 2009; Platzbecker et al. 2017). Aufgrund dieser Daten werden mittlerweile in vielen Studien APL-Patienten mit MRD-Persistenz oder MRD-Rezidiv nach Therapieende präemptiv behandelt.

Auch für andere Formen der AML zeigten zwei große durchflusszytometrische Studien die unabhängige prognostische Bedeutung der MRD (Terwijn et al. 2013; Freeman et al. 2013). In einer multizentrischen Studie an jüngeren AML-Patienten war eine MRD-Persistenz >0,1 % nach zwei Zyklen Chemotherapie assoziiert mit einem erhöhten Rezidivrisiko, in einer britischen Untersuchung wiesen ältere Patienten (>60 Jahre) mit MRD-Negativität nach einem Zyklus Chemotherapie im Vergleich mit den MRD-positiven Patienten ein signifikant besseres Überleben auf. Für die NPM1-mutierte AML zeigten Ivey et al. 2016 anhand der Analyse mutierter NPM1-Transkripte die unabhängige prognostische Bedeutung einer MRD-Persistenz nach zwei Chemotherapiezyklen. Auch Patienten mit CBFB-MYH11-AML weisen bei MRD-Persistenz eine erhöhte Rezidivrate auf. Allerdings führt dies in einer multivariaten Analyse zu keinem signifikanten Effekt auf das Gesamtüberleben, wahrscheinlich aufgrund des guten Ansprechens dieser Patienten auf Salvage-Therapien (Yin et al. 2012). Deshalb wird generell bei diesen Patienten keine MRD-basierte Therapie empfohlen.

In einer Konsensusempfehlung des European LeukemiaNets wird die MRD-Messung nach zwei Zyklen Chemotherapie und am Ende der Therapie empfohlen sowie bei Patienten, die allogen transplantiert werden sollen, vor der Konditionierungstherapie, jeweils in Blut und Knochenmark.

Chronische lymphatische Leukämie

Für die chronische lymphatische Leukämie (CLL) stehen zur MRD-Quantifizierung sowohl molekulare (IG-Rearrangements) als auch durchflusszytometrische Methoden zur Verfügung.

Auch für die CLL ist das Erreichen einer MRD-Negativität der wichtigste unabhängige prognostische Faktor unter Chemo(immun)therapie (Böttcher et al. 2012). In der CLL8-Studie der deutschen CLL-Studiengruppe wiesen Patienten bei Erreichen des gleichen MRD-Status eine identische Prognose auf, unabhängig davon, ob sie diesen MRD-Status durch alleinige Chemotherapie (Fludarabin + Cyclophosphamid) oder über eine um Rituximab ergänzte Therapie erhalten hatten. Gegenüber der konventionellen Remissionsbeurteilung erlaubte die MRD-Quantifizierung eine deutlich verbesserte Remissionsbeurteilung (Kovacs et al. 2016). Insbesondere eine persistierende Splenomegalie hatte bei Erreichen einer MRD-Negativität (<0,01 %) keine prognostische Bedeutung.

Allerdings führte der Einsatz von B-Zell-Rezeptor-(BCR-)Signalling-Pathway-Inhibitoren bei der CLL zum Paradigmenwechsel, da durch eine Monotherapie zwar eine dramatische Reduktion der nodalen Tumormasse und eine Blutbildnormalisierung bewirkt wird, die CLL im Knochenmark jedoch oftmals persistiert (Byrd et al. 2014).

Die prognostische Bedeutung der MRD unter Therapie mit Kinase-Inhibitoren ist bisher noch ungeklärt. Aktuelle internationale Leitlinien (Hallek et al. 2018) empfehlen die Bestimmung von MRD im Rahmen von klinischen Studien an Blutproben, bei Erreichen einer MRD-Negativität im Blut auch an Knochenmarkaspiraten. Außerhalb von klinischen Studien wird die Bestimmung von MRD nicht generell empfohlen.

Chronische myeloischen Leukämie

Die MRD-Quantifizierung stellt bei der chronischen myeloischen Leukämie (CML) einen integralen Bestandteil der Verlaufsbeurteilung und Therapiesteuerung dar.

Die Kontrolle des Therapieansprechens bei der CML erfolgt auf hämatologischer, zytogenetischer und molekularer Ebene. Der molekulare Response (MR) misst hierbei die Reduktion der BCR-ABL1-Fusionstranskripte im Vergleich zu einem Housekeeping-Gen (ABL oder GUS). Die BCR-ABL1-Transkripte werden hierbei auf eine internationale Skala (IS) bezogen, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen den Laboren zu ermöglichen.

Verschiedenste klinische Studien demonstrierten die klinische Bedeutung der MRD bei der CML und führten zur Definition von MR-Meilensteinen, die zu festgesetzten Zeitpunkten unter der Therapie erreicht werden sollten. Als Major MR (MMR) ist eine Reduktion der BCR-ABL1-Transkripte auf ≤0,1 % nach IS definiert, die MR⁴, MR^4,5 bzw. MR⁵ bezeichnen eine Reduktion auf ≤0,01 %, ≤0,0032 % bzw. ≤0,001 % mit einer Mindestmenge analysierter Kontrolltranskripte. Eine noch höhere Sensitivität der Analyse ist mit der klassischen RQ-PCR nicht möglich. Inwieweit neue DNA- oder RNA-basierte Hochdurchsatzmethoden wie NGS und ddPCR eine weitere Verbesserung der Sensitivität ermöglichen, bleibt abzuwarten.

Die Bewertung der Effektivität der Tyrosinkinase-Inhibitor-(TKI-)Therapie erfolgt nach den derzeit gültigen Leitlinien des European LeukemiaNet (Baccarani et al. 2013). Nach Erreichen einer kompletten zytogenetischen Remission (d. h. fehlender Nachweis Philadelphia-Chromosom-positiver Metaphasen) erfolgen weitere molekulare Kontrollen anhand der Analyse von Blut. Ein optimales Ansprechen nach 3, 6 und ≥12 Monaten wird als eine BCR-ABL1-Last von ≤10 %, ≤1 % bzw. ≤0,1 % definiert. Als „Warnung“ sind zu den entsprechenden Zeitpunkten BCR-ABL1-Ratios von >10 %, >1–10 % und >0,1–1 % anzusehen, Werte über diesen Cut-offs entsprechen einem Versagen der TKI-Therapie. Nach Erreichen einer stabilen MMR sollte MRD weiter alle 3–6 Monate monitoriert werden. Als Therapieversagen ist ein Verlust einer MMR mit mindestens 5-fachem BCR-ABL1-Anstieg anzusehen. Zunehmend wird die MRD-Messung bei der CML auch eingesetzt, um bei ausgewählten Patienten mit ausreichend langer und ausreichend tiefer Remission die TKI-Therapie abzusetzen (siehe Kap. „Chronische myeloische Leukämie (CML)“).

Lymphome

Follikuläres Lymphom und Mantelzelllymphom

Bei malignen Lymphomen werden vor allem für follikuläre Lymphome (FL) und Mantelzelllymphome (MCL) DNA-basierte MRD-Messmethoden angewendet. Systematische MRD-Daten zu aggressiven Lymphomen fehlen weitgehend. Dies beruht im Wesentlichen auf der fehlenden Verfügbarkeit ausreichender Mengen diagnostischer Tumor-DNA für die Markeridentifikation und PCR-Etablierung. Hier stellt die Erfassung zirkulierender zellfreier Tumor-DNA (ctDNA) im Plasma mittels NGS eine neue Möglichkeit für die MRD-Erfassung dar. Als MRD-Marker können hier sowohl klonale Immungenumlagerungen als auch onkogene Mutationsprofile im Verlauf über NGS-basierte Techniken an Liquid-Biopsy-Proben verfolgt werden und ermöglichen neben der Erfassung von MRD auch Aussagen zur klonalen Evolution im Zeitverlauf (Roschewski et al. 2016).

Die PCR-basierte Erfassung der junktionalen Regionen des Immunglobulinschwerkettengens (IGH) mittels allelspezifischer RQ-PCR gilt für FL und MCL als Goldstandard für die Erfassung von MRD. Allerdings wird die Sensitivität und Spezifität der Untersuchung auch in allelspezifischen Ansätzen wesentlich durch die Mutationsfrequenz des IGH-Gens mitbestimmt, da es hier durch klonale Heterogenität und Mutationen in Primerbindungsstellen vor allem bei den stark mutierten Keimzentrumslymphomen wie den follikulären Lymphomen zu verminderter Sensitivität kommen kann. Als zusätzliche MRD-Marker stehen für beide Lymphomsubtypen die charakteristischen Chromosomentranslokationen t(14;18)(q32;q21) bei follikulären Lymphomen und die t(11;14)(q13;q32) bei Mantelzelllymphomen zur Verfügung. Im Gegensatz zum IGH-Lokus unterliegen beide Translokation keiner starken somatischen Hypermutation, sodass das BCL2/IGH-Fusionsgen bzw. die junktionale Region der t(11;14)(q13;q32)-Translokation stabile MRD-Marker darstellen.

Die Translokation t(14;18) ist insgesamt bei etwa 90 % der Patienten mit FL mittels FISH (Leich et al. 2011), jedoch nur in etwa 50–60 % dieser Fälle mittels Multiplex-PCR nachweisbar. Gleiches gilt für die t(11;14)-Translokation, die mit PCR-basierten Ansätzen nur in 30 % der Fälle detektierbar ist (Evans et al. 2007).

Für die quantitative Erfassung der t(14;18)-Translokation werden keine klonspezifischen Primer benötigt, hier kann ein bruchpunktspezifischer Vorwärtsprimer im Chromosom 18 platziert und mit einer Konsensussonde und einem reversen Primer in der Joining-Region verwendet werden (Ladetto et al. 2008). Diese Methode ist daher wesentlich einfacher durchführbar und wurde in den meisten publizierten Studien zur MRD-Erfassung von FL eingesetzt und erreicht eine Sensitivität von 10⁻⁵.

Die Quantifizierung von Verlaufsproben mittels RQ-PCR erfolgt im Allgemeinen über die Erstellung einer seriellen Standardverdünnungsreihe aus diagnostischem Primärmaterial mit bekannter Kopienzahl. Dies stellt für nodale Lymphome eine besondere Herausforderung dar, da der Tumorgehalt verfügbarer Knochenmark- und Blutproben für die Erstellung der Standardverdünnungsreihe oftmals nicht ausreicht und hochmolekulare DNA von Tumorbiopsaten im MRD-Labor nicht verfügbar ist. In diesen Fällen werden zum Teil klonspezifische Plasmide für die Erstellung der Standards verwendet.

Der molekulargenetisch bestimmte Infiltrationsgrad im Knochenmark und die Menge zirkulierender Lymphomzellen im Blut bei Diagnose reflektieren ähnlich wie die PET/CT-Untersuchung die prätherapeutische Tumormasse. Ihre quantitative Erfassung hat eine prognostische Relevanz im Hinblick auf das Therapieansprechen und das erkrankungsfreie bzw. progressionsfreie Überleben (Rambaldi et al. 2005; Zohren et al. 2015).

Für Patienten mit follikulären FL und MCL konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass das Erreichen einer klinischen und molekularen Remission sowohl nach konventioneller Chemotherapie, nach Hochdosistherapie mit autologer Stammzelltransplantation als auch nach kombinierten Immunchemotherapieprotokollen mit einem verlängerten ereignisfreien Überleben und einer günstigen Prognose verknüpft ist. Das Erreichen einer MRD-Negativität ist der wichtigste unabhängige prognostische Faktor unter Chemoimmuntherapie, unabhängig davon, durch welche Therapie das MRD Ansprechen erreicht wird (Ladetto et al. 2008; Pott et al. 2010). Bei Patienten unter einer Erhaltungstherapie mit Rituximab zeigt das Wiederauftreten residualer Lymphomzellen eine Korrelation zum klinischen Rezidiv und ist mit einer ungünstigeren Prognose verbunden (Ladetto et al. 2013). Generell gilt, dass eine Untersuchung aus dem Knochenmark nach einer kombinierten Immunchemotherapie oder unter einer Erhaltungstherapie mit einem monoklonalen B-Zell-Antikörper eine größere Sensitivität aufweist als eine Analyse aus dem Blut (Pott et al. 2016). Da die Persistenz von MRD oder das Wiederauftreten auf ein unzureichendes Ansprechen bzw. eine Resistenzentwicklung gegenüber der verabreichten Therapie hindeutet, kann – in klinischen Studien – auf Basis des molekularen Ansprechens eine Therapieumstellung oder der Einsatz zielgerichteter Therapien erwogen werden. Außerhalb von klinischen Studien wird die Bestimmung von MRD nicht empfohlen.

Multiples Myelom

Beim multiplen Myelom erfolgt die MRD-Messung vornehmlich mittels Vielfarbendurchflusszytometrie. In den letzten Jahren hat sich aber auch die IG-NGS-Analyse als molekulares MRD-Messverfahren für das Myelom etabliert. Beide Verfahren, das Next Generation Flow und das NGS, wurden 2016 in die Response-Kriterien der International Myeloma Working Group aufgenommen (Kumar et al. 2016). Der direkte Nachweis der Myelomzellen im Knochenmark hat gegenüber den konventionellen Response-Markern, insbesondere dem Paraprotein, den Vorteil der höheren Empfindlichkeit und höheren Spezifität und korreliert besser mit progressionsfreiem und Gesamtüberleben (Lahuerta et al. 2017). Allerdings werden fokale Erkrankungen außerhalb des Knochenmarks unzureichend detektiert. Aufgrund dessen wird in klinischen Studien zum Teil die MRD-Messung mit sensitiven bildgebenden Verfahren kombiniert.

Solide Tumoren

Maligne Tumoren epithelialer Gewebe stellen die Mehrzahl aller Krebsneuerkrankungen dar und verursachen auch das Gros aller krebsbezogenen Todesfälle in den westlichen Industrieländern. Die Mortalitätsrate wird wesentlich durch die frühzeitige und zum Zeitpunkt der Erstdiagnose oftmals okkulte Tumorzelldisseminierung bestimmt.

Durch Kombination immunzytologischer und molekularer Techniken konnte eindrucksvoll die ausgeprägte genetische Heterogenität einzelner mikrometastatischer Tumorzellen bei individuellen Patienten bestimmt werden (Turajlic und Swanton 2016). Diese Untersuchungen weisen darauf hin, dass adjuvante Therapieverfahren mit einem großen Reservoir heterogener mikrometastatischer Zellen konfrontiert werden, von denen resistente Tumorzellen selektioniert werden können. Mikrometastatische Zellen epithelialer Tumoren im Knochenmark haben zudem ein sehr heterogenes proliferatives Potenzial. Die prognostische Relevanz dieser zirkulierenden Tumorzellen wird noch kontrovers diskutiert und in dem Kap. „Zirkulierende Tumorzellen“ ausführlich besprochen. Zunehmende Bedeutung gewinnt für solide Tumoren aber die Liquid Biopsy, der Nachweis zellfreier DNA/RNA in Serum bzw. Blutplasma. Auch hier verweisen wir auf das Kap. „Liquid Biopsy: Zirkulierende Tumor-DNA/RNA“.

Schlussfolgerung und Ausblick

Die Analyse minimaler Resterkrankung gewinnt bei hämatologischen Neoplasien zunehmend an Bedeutung und ist bei der CML und ALL bereits integraler Bestandteil einer risikobasierten Therapiestratifikation. Zukünftig wird neben der bloßen Quantifizierung möglicherweise eine genauere Charakterisierung der MRD relevant, um Targets für zielgerichtete Therapien identifizieren zu können. Für solide Tumoren sind echte MRD-Messungen weniger etabliert. Hier hat sich erst in den letzten Jahren mit der Verfügbarkeit von Hochdurchsatztechnologien der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen bzw. zellfreier DNA/RNA im Blutplasma als Möglichkeit entwickelt, im Therapieverlauf MRD repräsentativ zu messen.

Literatur

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