Zirkulierende Tumorzellen

In den letzten 10 Jahren wurde intensiv in Large-Scale-Studien an der Bedeutung von zirkulierenden Tumorzellen („circulating tumor cells“, CTCs) sowohl für die Diagnose, Prognose als auch das Therapieansprechen geforscht. Da die Therapie sich zunehmend in Richtung einer personalisierten Medizin entwickelt, ist der Nachweis von Therapietargets, wie die Expression bestimmter Proteine oder das Vorhandensein von charakteristischen Mutationen in den Tumorzellen, von großer Bedeutung, um die optimale Therapieentscheidung für den Patienten zu treffen.

Das Standardverfahren ist die Untersuchung des Primärtumors oder der Metastase mittels Biopsie. Allerdings ist nicht jeder Tumor oder jede Metastase aufgrund der Lokalisation zugänglich für eine Gewebeentnahme (z. B. Gehirn, Knochen). Ein weiteres Problem besteht durch die genomische Instabilität der Tumorzellen. Durch die daraus resultierende genomische Heterogenität und den stetigen Selektionsdruck der systemischen Therapien (z. B. Chemotherapie) können Jahre später auftretende Metastasen eventuell nicht mehr die gleiche Komposition an molekularen Markern und Therapietargets wie der ursprüngliche Primärtumor besitzen. Gerade Metastasen sind für Nadelbiopsien, ein invasives Verfahren, das von Nebenwirkungen wie Blutungen begleitet werden kann, schwieriger zu erreichen. Bestimmte Orte wie die Lunge, das Gehirn oder das Skelettsystem sind prinzipiell nur schwer (wenn überhaupt) zugänglich.

Dringend wird daher eine minimalinvasive Methode benötigt, um den Verlauf der Tumorerkrankung und das Therapieansprechen in regelmäßigen Zeitabständen zu monitoren. Hier bieten sich sequenzielle Blutanalysen als Alternative oder Erweiterung in der Tumordiagnostik an.

Vor knapp 10 Jahren wurde ein neues Forschungsfeld unter dem Namen Liquid Biopsy eingeführt (Pantel und Alix-Panabieres 2010). Hierbei werden neben den CTCs auch Komponenten, die von den Primärtumoren oder Metastasen ins Blut abgegeben werden, wie z. B. ctDNA, miRNA oder Exosomen, als neue Biomarker auf Eigenschaften untersucht, die für die Früherkennung, die Risikostratifizierung oder die Therapieentscheidung relevant sind (Bardelli und Pantel 2017; Alix-Panabieres und Pantel 2016).

Schon in der Mitte des 19. Jahrhunderts wurde untersucht, ob zirkulierende Tumorzellen im Blut aufgrund ihrer Morphologie nachweisbar sind (Alexander und Spriggs 1960; Salsbury 1975). Diese Beurteilung war sehr komplex und die Ergebnisse somit widersprüchlich. Erst durch immer bessere Anreicherungsmethoden und zusätzliche molekularbiologische Charakterisierungen auf Protein- und DNA-Ebene konnten eindeutige Beweise für das Vorhandensein von CTCs erbracht werden. Aber auch heute steht die Forschung noch vor der Herausforderung der standardisierten Auswertung. In diesem Zusammenhang sind die Etablierung des EU-Netzwerkes CANCER-ID (http://www.cancer-id.eu; EFPIA-Koordination: Th. Schlange; wissenschaftliche Leitung: K. Pantel) und die Gründung der European Liquid Biopsy Society (ELBS) wichtige Meilensteine.

CTCs, die sich vom Primärtumor oder einer Metastase gelöst haben und durch den Blutstrom wandern, haben eine sehr geringe Halbwertszeit von nur 1–2,4 Stunden (Meng et al. 2004). Sie sterben durch Anoikis, Scherkräfte oder werden durch das Immunsystem eliminiert (Hench et al. 2018). Im Blut können CTCs als einzelne Zellen nachgewiesen werden oder auch als Cluster.

CTC-Cluster können aus mehreren neoplastischen Zellen bestehen oder auch Fibroblasten, Leukozyten, Endothelzellen und Thrombozyten enthalten (Hench et al. 2018). Verschiedene Studien haben gezeigt, dass das Auftreten von Clustern mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist. Wahrscheinlich wirken sich die nach außen gewandten Zellen des Clusters schützend auf die CTCs in ihrer Mitte aus. Bei verschiedenen Tumorentitäten konnten diese Tumorzellcluster im Blut nachgewiesen werden, z. B. bei Patienten mit Lungen-, Kolon-, Nieren- und Prostatakarzinom (Douma et al. 2004).

Der Nachweis und die Untersuchung von CTCs erfordern hoch spezifische und sensitive Methoden, da auf eine CTC 10⁶–10⁸ normale Blutzellen kommen (Pantel und Alix-Panabieres 2016).

Zur Isolierung der CTCs werden entweder biologische oder physikalische Methoden verwendet. Die physikalischen Verfahren nutzen die Eigenschaften der CTCs, dass sie generell größer und rigider als Blutzellen sind. In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl verschiedener physikalischer Technologien entwickelt, die sich in membranbasierte Filtrationen, mikrofluidische Chips, dichtebasierte Zentrifugationen und elektrische Auftrennungen einteilen lassen.

Biologische Verfahren nutzen typischerweise Oberflächenproteine der CTCs, die eine klare Unterscheidung von den Blutzellen ermöglichen. Der meist verwendete Marker ist das epitheliale Zelladhäsionsmolekül („epithelial cell adhesion molecule“, EpCAM). Dieses Protein, das von den Blutzellen nicht exprimiert wird, ist auf den meisten CTCs aufgrund ihres epithelialen Ursprungs nachweisbar und kann daher zur CTC-Isolierung genutzt werden. Verfahren, die eine CTC-Isolierung über EpCAM nutzen, werden von verschiedenen Firmen angeboten. Unter ihnen stellt das CellSearch®-System (CS) den Goldstandard dar. Es ist bisher das einzige Verfahren der CTC-Anreicherung und -Detektion, das von der FDA für den klinischen Einsatz zugelassen wurde.

Beim Verfahren des CS werden die Tumorzellen zuerst mittels EpCAM isoliert. Dieser Schritt ist sehr sensitiv, aber weniger spezifisch. Im zweiten Schritt werden die isolierten Zellen mittels Immunfluoreszenzfärbung gegen Zytokeratine und CD45 gefärbt. Leukozyten können durch die CD45-Färbung ausgeschlossen werden. CTCs werden definiert als EpCAM+, Zytokeratin+ und CD45-.

Zahlreiche klinische Studien mit unterschiedlichen Tumorentitäten konnten zeigen, dass der Nachweis von CTCs mittels CS ein unabhängiger, prognostischer Marker für das Überleben von Krebspatienten darstellt. Eine sehr gute Übersicht zu den CS-Studien liefert der Artikel von Riethdorf et al. (Riethdorf et al. 2018a).

Die größte Limitation des CS liegt allerdings in der Abhängigkeit von der EpCAM-Expression. Tumorzellen können im metastatischen Prozess durch Epithelial-zu-mesenchymal-Transformation (EMT), ein mehrschrittiger Prozess, der verschiedene molekulare Eigenschaften der CTCs beeinflusst, ihren epithelialen Charakter verlieren. Durch EMT werden zum einen epitheliale Proteine wie E-Cadherin, Claudine und Zytokeratine runterreguliert und im Gegenzug mesenchymale Proteine wie N-Cadherin, Fibronektin und Vimentin hochreguliert. Diese Veränderungen erlauben den Tumorzellen mehr Mobilität und Invasivität. Reguliert wird dieser Vorgang durch Transkriptionsfaktoren, auch als EMT-induzierende Transkriptionsfaktoren (EMT-TFs) beschrieben. Dazu gehören Snail 1, Snail 2(Slug), ZEB, Twist, TCF4 und FOXC2. Auch bei verschieden extrazellulären Faktoren (TGF-beta, FGF, EGF, HGF, Wnt, Notch, Hedgehog etc.) aus der Tumormikroumgebung geht man davon aus, dass sie EMT der Tumorzellen fördern.

CTCs, die negativ für EpCAM sind und einen mesenchymalen Phänotyp zeigen, konnten mit verschiedenen CTC-Detektionsmethoden nachgewiesen werden (Aktas et al. 2009; Raimondi et al. 2011; Giordano et al. 2012; Alix-Panabieres et al. 2017; Gradilone et al. 2011; Schneck et al. 2015; Mego et al. 2015; Guan et al. 2016; Bredemeier et al. 2016; Hensler et al. 2016). Welche klinische Relevanz diese mesenchymalen CTCs im Vergleich zu EpCAM+ CTCs haben, ist noch nicht ausreichend untersucht.

Die Zahl der Publikationen und klinischen Studien im Bereich CTC-Analysen nimmt seit 10 Jahren stetig zu (Abb. 1).

In den folgenden Abschnitten werden klinische Anwendungen der CTC-Analyse hinsichtlich der am besten untersuchten Tumorentitäten beschrieben: Brustkrebs, Lungenkrebs und Prostatakrebs. Die CTC-Analysen erstrecken sich natürlich auf wesentlich mehr Tumorentitäten wie kolorektale Karzinome, Pankreaskarzinom, Hodenkarzinom (Yokobori et al. 2013; Effenberger et al. 2018; Nastaly et al. 2014), Kopf-Hals-Tumoren (Grobe et al. 2014), Melanom (Hong et al. 2018) oder Merkelzellkarzinom (Riethdorf et al. 2018b).

Die meisten CTC-Studien wurden zum Mammakarzinom durchgeführt. Beim metastasierten Mammakarzinom ist das Vorhandensein von ≥5 CTCs/7,5 ml Blut (nachgewiesen mittels CS) ein unabhängiger prognostischer Faktor für das Gesamtüberleben und das progressionsfreie Überleben (Pierga et al. 2012; Cristofanilli et al. 2004, 2005; Dawood et al. 2008; Jauch et al. 2018); die CTC-Bestimmung kann helfen, ein Therapieversagen frühzeitig zu erkennen (Tokudome et al. 2011; Bidard et al. 2014). Allerdings konnte in einer Studie mit 595 Patientinnen (SWOG S0500) kein längeres Überleben durch einen frühzeitigen Therapiewechsel bei steigender CTC-Zahl erreicht werden (Smerage et al. 2014). Die CTC-Bestimmung hatte zwar ein prognostisch schlechtes Kollektiv identifiziert, für das es aber keine effiziente alternative Chemotherapie gab.

Zukünftige interventionelle Studien (wie z. B. die DETECT-Studien) mit einer besseren Stratifizierung der Patienten und dem Einsatz von modernen, zielgerichteten Therapeutika wie Antikörpern oder pharmakologischen Inhibitoren könnten hier erfolgversprechender sein. Zudem könnte ein früherer Einsatz der CTC-Bestimmung zur Therapieentscheidung von Vorteil sein, um ein noch therapierbares Kollektiv von metastasierten Patienten zu identifizieren, die von der CTC-basierten Therapieentscheidung profitieren können. Die auf den San Antonio Breast Cancer Symposium 2018 vorgestellten Ergebnisse der französischen Multizenterstudie METABREAST zeigen, dass die CTC-Bestimmung bei Patientinnen mit metastasiertem ER-positivem Mammakarzinom einen sinnvollen Beitrag zur Therapiewahl leisten kann.

Beim Mammakarzinom lässt sich die prognostische Relevanz von CTCs bereits in frühen Tumorstadien demonstrieren (Rack et al. 2014). In einer Studie an 3173 Patientinnen ohne klinisch-radiologisch nachweisbare Metastasierung (Stadium M0) konnte gezeigt werden, dass der CTC-Nachweis ein unabhängiger prognostischer Faktor für ein schlechteres rezidivfreies und Gesamtüberleben darstellt (Janni et al. 2016). In den meisten Studien zum Mammakarzinom im Stadium M0 zeigt der CTC-Status eine zu den bekannten klinischen Risikoparametern unabhängige prognostische Bedeutung (Rack et al. 2014; Sandri et al. 2010; Krishnamurthy et al. 2010; Lucci et al. 2012; Hall et al. 2016; Hartkopf et al. 2016).

In einer neuen, multizentrischen Untersuchung zum M0-Mammakarzinom konnte gezeigt werden, dass die CTC-Anzahl bei Patientinnen, die eine neoadjuvante Therapie erhielten, ein unabhängiger prognostischer Faktor für das Gesamtüberleben war (Riethdorf et al. 2017). Diese Arbeit wurde durch eine große Metaanalyse an mehr als 2000 Patientinnen validiert; hierbei war das Risiko eines Rezidivs um mehr als das 6-Fache erhöht, wenn ≥ 5 CTCs in der Blutprobe (mit CS analysiert) gefunden wurden (Bidard et al. 2018).

Der Fokus aktueller laufender Studien liegt vor allem auf dem Nachweis von therapeutischen Zielstrukturen, wie z. B. ER, HER2, EGFR und PD-L1, insbesondere beim metastasierten Mammakarzinom (Riethdorf et al. 2018a). Hier kann man eine Divergenz zwischen dem ursprünglich am Primärtumor festgestellten Status und dem Status der CTCs zum Zeitpunkt der Metastasierung feststellen. So war die Inzidenz des immuninhibitorischen Proteins PDL1, einem der Schlüsselziele für die neuen immunonkologischen Therapien, wesentlich höher zum Zeitpunkt des metastatischen Rezidivs (Mazel et al. 2015), was auf einen möglichen Selektionsvorteil, dem Immunsystem zu entkommen, hinweist. Zukünftige interventionelle Studien müssen nun klären, inwieweit diese Charakterisierung zu einer besseren Therapieentscheidung beitragen kann. Immunonkologische Therapien sind nur bei einem Teil der Krebspatienten effektiv, und sie können erhebliche Nebenwirkungen induzieren, sodass prädiktive Biomarker dringend benötigt werden.

Die Untersuchungen zu CTCs beim Lungenkarzinom mit dem CS zeigen starke Unterschiede zwischen kleinzelligem Lungenkarzinom (SCLC) und nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC). So konnten in einer der ersten Studien zu NSCLC nur in 20 % der metastasierten NSCLC-Patienten CTCs mit dem CS detektiert werden (Allard et al. 2004), wohingegen für SCLC die Positivitätsrate zwischen 67–86 % lag (Riethdorf et al. 2018a). In verschiedenen Studien zu SCLC konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte CTC-Rate mit einem schlechteren Therapieansprechen, einer erhöhten Anzahlen an Metastasen und einem schlechteren Gesamtüberleben korreliert ist (Naito et al. 2012; Tanaka et al. 2009; Hou et al. 2012).

Beim nicht metastasierten NSCLC ist es in vielen Fällen nicht möglich, CTCs mit dem CS zu finden und der CTC-Nachweis hängt von der Lokalisation der Metastasierung ab (Hanssen et al. 2016). Trotz diesen Limitationen korreliert ein Cut-off von 5 CTCs/7,5 ml Blut mit einem deutlich schlechteren progressionsfreien Überleben. Eine mögliche Erklärung für die niedrigen CTC-Raten könnte ein mesenchymaler Zustand der CTCs sein. Es wurden verschiedene Studien mit EpCAM unabhängigen Systemen durchgeführt, die auf Größenfiltration oder einer negativen Anreicherung über CD45 beruhten, dabei waren 50–100 % der Patienten mit Lungenkrebs im Stadium 2–4 positiv für CTCs. Gerade für die Untersuchung von möglichen Therapietargets, wie z. B. PD-L1, ist es zwingend notwendig, eine größere Anzahl CTCs pro Patienten zu analysieren. So konnten Guibert et al. mit einer Filtrationsanreicherung die PD-L1-Expression auf CTCs unter Nivolumab-Therapie untersuchen (Guibert et al. 2018). Auch die Früherkennung von NSCLC scheint mit EpCAM-unabhängigen Systemen möglich zu sein. Ilie et al konnten mithilfe einer Filtrationstechnik bei COPD-Patienten ohne nachgewiesenem NSCLC CTCs detektieren und eine Korrelation mit dem Auftreten von Tumoren zeigen (Ilie et al. 2014).

Weitere Untersuchungen mit größeren Fallzahlen sind für die klinische Etablierung dieser Techniken dringend notwendig.

Im Falle des kastrationsresistenten, metastasierten Prostatakarzinoms lassen sich mittels CTC-Analytik bereits Therapieresistenzen nachweisen. Im Allgemeinen werden Veränderungen des PSA-Werts genutzt, um das Therapieansprechen festzustellen, die Korrelation zum Gesamtüberleben ist allerdings gering. Als Endpunkt wurden deshalb in fünf prospektiven, randomisierten Phase-III-Studien (gesamt 6081 Patienten) CTC-Bestimmungen verwendet. Bei den fünf CTC-basierten und drei PSA-Level-basierten Endpunkten hatten die folgenden CTC-Endpunkte die stärkste Aussagekraft bezüglich des Gesamtüberlebens:CTC0 wurde bei 75 % der Patienten festgestellt, aber nur bei 51 % wurde eine CTC-Konversion gemessen. CTC0 war in dieser Studie ein klinisch aussagekräftigerer Endpunkt als eine Veränderung des PSA-Levels (Heller et al. 2018).

Beim kastrationsresistenten, metastasierten Prostatakarzinom werden häufig neue Hormonblocker wie Abirateron oder Enzalutamid eingesetzt. Diese Wirkstoffe blockieren die Androgenproduktion oder die Ligandenbindedomäne des Androgenrezeptors. Neuste Studien zeigen, dass durch eine mRNA-Splicevariante des Androgenrezeptors Therapieresistenzen entstehen. Auch in CTCs wurde diese Splicevariante (ARV7) in der mRNA nachgewiesen, und sie konnte mit einer Resistenz gegenüber Abirateron und Enzalutamid assoziiert werden. Patienten ohne CTCs zeigten das beste Therapieansprechen, gefolgt von Patienten mit CTCs, die kein ARV7 aufwiesen. Am schlechtesten reagierten Patienten, die CTCs mit der Resistenzvariante im Blut zeigten (Antonarakis et al. 2017). Neuere Studien haben zudem erwiesen, dass sich der ARV7-Status unter Antiandrogentherapie verändern kann. Der Nachweis von ARV7 gelingt auch auf Proteinebene, und die Arbeiten zur klinischen Relevanz in Bezug auf den prädiktiven Wert dieser Untersuchungen in Richtung „clinical utility“ sind sehr ermutigend, da Patienten mit ARV7-positiven CTCs immer noch von einer Chemotherapie mit Taxanen profitieren (Scher et al. 2016, 2017a,b, 2018; Armstrong et al. 2018). Interessanterweise kann der ARV7-Status in individuellen Patienten heterogen sein (Gorges et al. 2016), und diese Heterogenität beeinflusst auch die Wirkung von Abirateron und Enzalutamid (Scher et al. 2017b).

Verschiedene kleinere Studien zum frühen lokal begrenzten Prostatakarzinom konnten dagegen bisher nur einen sehr begrenzten Nutzen der CTC-Messungen zeigen. Eine Kombination von drei verschiedenen CTC-Assays wurde von Kuske et al. bei Hochrisikopatienten Patienten (hoher PSA-Wert, hoher Gleason-Score) untersucht. Die kumulierte Positivität lag bei 81,3 %, und 21 % hatten über 5 CTCs. Diese Studie weist daraufhin, dass eine Kombination verschiedener Plattformen notwendig ist, um die niedrige Frequenz und Heterogenität der Tumorzelldisseminierung beim Prostatakarzinom in frühen Stadien hinreichend zu erfassen (Kuske et al. 2016).

Die bisherigen Ergebnisse mit CTCs als Biomarker sind sehr vielversprechend. Insbesondere beim Mammakarzinom liegen sowohl für das frühe als auch für das metastasierte Stadium ausreichend große klinische Studien vor, die eine Relevanz für die Risikostratifizierung und das Therapiemonitoring zeigen. Ähnlich ermutigende Ergebnisse liegen für das metastasierte, kastrationsresistente Prostatakarzinom und das SCLC vor, wohingegen die niedrige Frequenz von CTCs beim NSCLC noch eine Herausforderung darstellt. Hier scheint die molekulare Analyse der ctDNA auf therapierelevante Mutationen (wie z. B. solche im EGFR-Gen) für die Therapieentscheidung erfolgversprechender zu sein (Bardelli und Pantel 2017).

Die Analyse von CTCs und anderer Liquid-Biopsy-Biomarker, wie der ctDNA, stellen somit komplementäre Verfahren dar, die je nach dem gewünschten Anwendungsgebiet gemeinsam mit den CTCs aus einer Blutprobe gewonnen werden können, um den Informationsgehalt zu maximieren. Beide Ansätze können dazu beitragen, die molekulare Evolution der Tumorzellen unter Therapieselektionsdruck besser zu verstehen. ctDNA-Analysen sind im Gegensatz zu den CTC-Analysen auf Veränderungen der DNA beschränkt und erfassen naturgemäß keine Therapieziele (z. B. PDL1) oder Resistenzmechanismen (z. B. ARV7), die durch Expressionsveränderungen entstehen und keine genetische Prägung haben.

Neben der Tumorzelle könnten sequenzielle Blutanalysen auch wertvolle Informationen über das aktuelle Mikromilieu liefern. Hier sind zirkulierende, extrazelluläre Vesikel wie die Exosomen sicherlich ebenso interessant wie zirkulierende miRNA, da beide Biomarker von Tumor- und Stromazellen ins Blut abgegeben werden und eine Reihe von tumorbiologisch relevanten Funktionen ausüben, wie z. B. die Bildung von prämetastatischen Nischen, die es den CTCs erleichtern, bestimmte Gewebe zu kolonisieren (Hoshino et al. 2015; Anfossi et al. 2018). Zukünftige Studien müssen nun klären, wie präzise die Blutanalysen die Situation im Gewebe der Patienten widerspiegeln und welche klinischen Konsequenzen aus dieser Information zu ziehen sind.