Immunpräzipitationsmethode zur quantitativen Bestimmung von Antigen in einer Probe. Hierzu lässt man geladene Proteine aus einer Probe elektrophoretisch in eine antikörperhaltige Agarosegelschicht (s. Agarosegelelektrophorese) einwandern. Dabei entstehen an den Äquivalenzzonen (Bereich der Bildung relativ stabiler Antigen-Antikörper-Komplexe) raketenförmige Präzipitatbögen, deren Peakhöhe proportional zur Antigenmenge in der Probe ist.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Erst wird ein Agarosesol hergestellt, indem man 1 g Agarose in 100 mL kochendem Puffer auflöst. Dann kühlt man das Sol auf 55 °C ab, mischt die Antikörper dazu und gießt es auf eine Glasplatte aus. Aus dem erstarrten Gel werden mit einer Stanzkanüle die Probenauftragslöcher ausgestanzt.
Die Elektroimmundiffusion beschleunigt immunologische Analysen, die ansonsten auf einfacher Diffusion beruhen. Wie in Abb. 1 gezeigt ist, entstehen raketenförmige Präzipitatbögen.
Abb. 1
Elektroimmundiffusion, auch Raketen-Elektrophorese nach Laurell genannt. Die Probe wandert elektrophoretisch in ein antikörperhaltiges Agarosegel ein. Das Antigen bildet mit dem Antikörper einen Präzipitatbogen. Die Höhe des Bogens ist ein Maß für die Antigenkonzentration
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Wenn Antigene elektrophoretisch in ein antikörperhaltiges Gel einwandern sollen, müssen Antigene und Antikörper unterschiedliche isoelektrische Punkte (Isoelektrischer Punkt) besitzen. Der Puffer wird auf denjenigen pH-Wert eingestellt, der dem isoelektrischen Punkt des verwendeten Antikörpers entspricht, damit der Antikörper nicht zu wandern beginnt. Falls Antigen und Antikörper denselben isoelektrischen Punkt haben, kann man (a) den isoelektrischen Punkt des Antigens oder (b) des Antikörpers durch Carbamylierung modifizieren. Im Fall (a) erhält man eine erhöhte Mobilität des Antigens in Richtung Anode. Im Fall (b) kann ein Puffer mit niedrigerem pH-Wert verwendet werden, wodurch das Antigen positive Ladungen erhält.
Es ist wichtig polyklonale Antikörper zu verwenden, da monoklonale Antikörper keine dreidimensionalen Immunkomplexe bilden.
Ursprünglich wurde Tris-Barbituratpuffer pH 8,6 verwendet. Wegen des Betäubungsmittelgesetzes (s. Betäubungsmittelgesetz) bekommt man nur noch sehr schwer Zugang zu Barbitursäure. Deshalb wird heutzutage meist ein Tris-Tricin-Calciumlactat-Puffer eingesetzt.
Die Präzipitatbögen werden nach Auswaschung der Antikörper mit physiologischer Salzlösung mit Coomassie-Färbung detektiert. Streng genommen ist das Integral der Präzipitatbogenflächen proportional zu der jeweiligen Antigenmenge. Zur Vereinfachung der Methode wird aber meist die Peakhöhe der Bögen verwendet; dies kommt dem Flächenwert sehr nahe. Zur Quantifizierung von Antigenen wird eine Verdünnungsreihe analysiert und eine Kalibrationskurve erstellt. Die Antigenkonzentration in einer Probe wird durch Interpolation bestimmt.
Die folgende Abbildung zeigt ein Beispiel für die Bestimmung von Lipoprotein(a) in Humanseren:
