Acylcarnitinprofil mit ESI-MS/MS aus Trockenblut

Acylcarnitin-Trockenblut-Elektrospray-Ionisations-Tandemmssenspektrometrie

acylcarnitine profiling from dried blood spot specimen

Simultane quantitative Bestimmung zahlreicher Acylcarnitine mittels Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) aus Trockenblut. Acylcarnitine sind Carnitinester der aus dem Fettsäurestoffwechsel, dem Stoffwechsel organischer Säuren oder verzweigtkettiger Aminosäuren stammenden Acyl-CoA-Verbindungen. Die Methode dient der Früherkennung angeborener Stoffwechselkrankheiten im Neugeborenenscreening und der selektiven Stoffwechseldiagnostik und Therapieverlaufskontrolle (Acetylcarnitin).

Aus der Trockenblutprobe werden die Analyte mit Methanol extrahiert, zu Butylestern derivatisiert und in Gasform mittels Elektrospray ionisiert. Die Ionen gelangen über elektrische Linsensysteme in das Tandemmassenspektrometer. Die Quantifizierung erfolgt zuverlässig über interne stabile Isotopenstandards und externe Kalibration (Abb. 1).

Bei der Quadrupol-Technologie erfolgt die Massenselektion durch Hochfrequenzfelder. Zur Fragmentierung wird eine mit Stickstoff gefüllte Kollisionseinheit verwendet. Durch spezifische Eltern- und Tochterionenexperimente können die einzelnen Analyte identifiziert werden (s. a. Abbildung im Stichwort Aminosäuren-Bestimmung mit ESI-MS/MS aus Trockenblut).

Acylcarnitine bilden bei der Fragmentierung ein geladenes Fragment der Masse m/z = 85. Für die Messung der Acylcarnitine wird deshalb die MS/MS im Precursor-Ionen-Scan-Modus (m/z 85) durchgeführt (MS 1 scannt 200–500 D – MS 2 bleibt fix auf m/z 85). Das resultierende Acylcarnitinprofil umfasst freies Carnitin und Acylcarnitine der Kettenlänge C2 bis C18, deren β-Kohlenstoffatom des Acylrests gesättigt, ein- oder zweifach ungesättigt, mono- oder dicarboxyliert und hydroxyliert sein kann.

Neugeborenenscreening, Stoffwechseldiagnostik.

Vollblut getrocknet auf Filterpapier (= Trockenblut).

Elektrospray-Tandemmassenspektrometer (Massenspektrometrie), Autosampler, HPLC-Pumpe, Mikrotiterfilterplatten, Mikrotiterplatten, Umluftrockenschrank, Abblasstationen, Pipetten, Computer.

Diagnostische Spezifität (Spezifität, diagnostische) im Screening ca. 99 %.

Analytische Spezifität: unterschiedlich für die einzelnen Acylcarnitin-Spezies.

Diagnostische Sensitivität (Sensitivität, diagnostische) im Screening für die meisten Zielkrankheiten >99 %.

Analytische Sensitivität: 0,05–2 μmol/L.

Freies Carnitin wird durch Butylierung und Erhitzen der Probe falsch zu hoch bestimmt.

Carnitinmangel führt zu falsch niedrigen Werten der Acylcarnitine. Während die Mehrzahl der Acylcarnitine in ähnlicher Konzentration in Trockenblut und Serum/Plasma auftreten, sind einige, insbesondere langkettige Acylcarnitine (z. B. C16 und C18), in nahezu zehnfach höherer Konzentration im Trockenblut zu finden. Die Verwendung von Verhältnissen (Ratios) einzelner Acylcarnitine, die zur Erhöhung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität im Neugeborenenscreening eingeführt worden sind, kann deshalb nicht einfach auf Acylcarnitinanalytik in Serum oder Plasma übertragen werden.

Praktikabilität: sehr gut.

Automatisierung: insbesondere bezüglich der Interpretation der Ergebnisse nur bedingt möglich.

Kosten: ca. 0,60–3,50 Euro/Test (Chemikalien und Verbrauchsmaterialien), Gesamtkosten hängen von der Probenzahl ab.

Die Bestimmung der Acylcarnitine mittels ESI-MS/MS stellt ein zuverlässiges, äußerst spezifisches und sensitives Verfahren zur Früherkennung einer ganzen Reihe angeborener Stoffwechselkrankheiten im Neugeborenenscreening dar. Die Bestimmung ist außerdem von Wert für die selektive Stoffwechseldiagnostik und zur Therapieverlaufskontrolle von Stoffwechselkrankheiten.