„Assisted Hatching“

Bei der PZD wird mit Hilfe einer spitzen Glaskapillare ein Schlitz in der Zona pellucida als permanente Öffnung erzeugt (Gordon und Talansky 1986). Das genaue Vorgehen ist in Abb. 1 illustriert. Diese Technik benötigt neben der erwähnten Glaskapillare die Zuhilfenahme einer Haltekapillare und wird in 2 aufeinander folgenden Manipulationsschritten ausgeführt.

Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie auf einer rein mechanischen Methode basiert. Jedoch besteht durch die Verwendung einer spitzen Kapillare und durch die auftretenden Scherkräfte die Gefahr, dass einzelne Blastomere des Embryos verletzt werden. Insbesondere können mit dieser Technik keine standardisierten Öffnungen mit einem definierten Durchmesser in der Zona pellucida erzeugt werden, sondern es wird vielmehr durch den Schlitz eine Schwachstelle innerhalb der Zona erzeugt, die der schlüpfende Embryo später bevorzugt nutzen kann.

Auch wenn die PZD historisch ihre Bedeutung hatte, so wird sie aktuell zum ausschließlichen Zweck des AH nicht mehr eingesetzt.

Der Einsatz einer sauren Tyrode-Lösung zur partiellen Eröffnung der Zona pellucida war eine der ersten Methoden, die ausschließlich für das AH entwickelt und angewandt wurden (Cohen et al. 1992). Saure Tyrode-Lösung hat einen pH-Wert von 2,5 und kann nur bei Embryonen eingesetzt werden, da eine Exposition von Eizellen mit dieser Lösung zu einer Beeinträchtigung bei der Embryonalentwicklung führen kann (Gordon et al. 1988). Insbesondere die später eingeführte Blastomerenbiopsie griff auf diese Technik zurück.

Die Anwendung dieses Verfahrens benötigt eine sehr große Erfahrung. Zunächst wird der Embryo derart an einer Haltekapillare fixiert, dass an der Stelle, die eröffnet werden soll, keine Blastomere mit direktem Kontakt zur Zona pellucida liegt. Mit einer zweiten Kapillare wird dann die saure Tyrode-Lösung auf die zu eröffnende Fläche aufgeblasen, wobei kontinuierlich die fortschreitende Auflösung der Zona pellucida kontrolliert werden muss. Sobald eine durchgehende Öffnung erzeugt ist, muss das Tyrode-haltige Medium sofort in die Applikationskapillare aufgezogen und der Embryo in eine neue Schale oder einen neuen Mediumtropfen umgesetzt werden.

Auch wenn dieses Verfahren in erfahrenen Händen gute Ergebnisse aufweist, so ist die Anwendung nicht ohne Risiken. Eine zu lange Exposition mit der sauren Tyrode-Lösung kann das Embryowachstum negativ beeinflussen und vermehrt zur Lyse von Blastomeren führen (Garrisi et al. 1990). Die Erzeugung von Zonaöffnungen mit einer definierten Größe ist mittels saurer Tyrode-Lösung nur schwer zu gewährleisten.

Die Inkubation von Embryonen in einer Pronase-Lösung führt zu einer gleichmäßigen Ausdünnung der Zona pellucida über die gesamte exponierte Oberfläche (Fong et al. 1997). Das Verfahren lässt sich kontrollierter durchführen als eine vergleichbare Behandlung mit Tyrode-Lösung. Es wird u. a. zum Transfer völlig zonafreier Blastozysten eingesetzt (Fong et al. 1997). Das Verfahren wird jedoch heute nur vereinzelt in Veröffentlichungen erwähnt.

Seit Beginn der 1990er-Jahre wurden verschiedene Lasersysteme für das Eröffnen der Zona pellucida eingesetzt. Bei den ersten Lasern handelte es sich um Kontaktlaser, die nur an der direkten Kontaktstelle zur Zona pellucida eine lokal eng begrenzte Eröffnung erzeugen konnten. Das Laserlicht musste hierzu mittels spezieller Kapillaren appliziert werden, und die Prozedur erforderte neben einer Haltkapillare und einer Laserapplikationskapillare auch Mikromanipulatoren. Es kamen ursprünglich verschiedene Laserwellenlängen zum Einsatz, die jedoch z. T. in einem für lebende Zellen kritischen Bereich lagen. Der erste kommerzielle kontaktfrei arbeitende Stickstofflaser verwendete ebenfalls eine Wellenlänge im UV-Bereich und konnte zudem nur sehr kleine Öffnungen im μm-Bereich erzeugen, sodass eine hohe Anzahl von Laserpulsen mit entsprechender Energiedeposition benötigt wurde (Übersicht in Montag et al. 2000c).

Die Sicherheit dieser Methode wurde in zahlreichen Publikationen belegt, und bis heute wurden nach zurückhaltenden Schätzungen mittels Laser-AH weltweit mehr als 100.000 Kinder geboren. Die Vorgehensweise beim laserassistierten Eröffnen der Zona pellucida ist in Abb. 2 gezeigt.

Alle derzeit gebräuchlichen kontaktfreien Lasersysteme können für die verschiedensten Anwendungen bei sachgemäßer Anwendung und entsprechender Expertise eingesetzt werden. Die Einfachheit des Verfahrens birgt jedoch das Risiko eines undifferenzierten Vorgehens mit u. U. problematischen Folgeerscheinungen. Prinzipiell führt eine künstlich erzeugte Öffnung dazu, dass der Embryo, sobald er innerhalb der ihn umgebenden Hülle eine Raumforderung kreiert, seitens der eröffneten Zona keinen Widerstand erfährt und somit die vorhandene Öffnung zum Schlüpfen benutzt. Daher kann man bei der Zona dieser Embryonen nach AH im weiteren Verlauf der Entwicklung und bei beginnender Expansion des Embryos kein weiteres Ausdünnen der Zona mehr erkennen. Stattdessen schlüpft der Embryo direkt durch die Öffnung, die durch das AH in der Zona geschaffen wurde. Der Zeitpunkt, zu dem der Prozess des Schlüpfens startet, ist dabei direkt von der Anzahl an verfügbaren Zellen des Embryos abhängig (Montag et al. 2000b).

Allerdings nutzt der Embryo auch alle ihm zur Verfügung stehenden Öffnungen für den Prozess des Ausschlüpfens. Werden beispielsweise zwei räumlich getrennte Öffnungen in der Zona erzeugt, so werden auch beide Öffnungen für das spätere Ausschlüpfen benutzt, und somit besteht eine nahezu 100 %-ige Chance, dass dieser Embryo letztendlich verkümmert.

Gleichermaßen bedeutsam ist die Größe der erzeugten Öffnung: Sobald diese einen bestimmten Durchmesser unterschreitet, besteht die Gefahr, dass der Embryo die Zona beim Schlüpfen nicht komplett verlassen kann und infolgedessen degeneriert.

Die hier skizzierten Probleme wurden in den 1990er-Jahren tierexperimentell untersucht, und auf ihre Bedeutung für eine erfolgreiche Applikation des AH wurde bereits damals hingewiesen (Montag und van der Ven 1999; Schmoll et al. 2003).

Eine Weiterentwicklung des AH führte zu dem sog. „zona thinning“ (Blake et al. 2001). Hierbei wird keine durchgehende permanente Öffnung erzeugt, vielmehr wird die Zona pellucida über eine größere Strecke hinweg ausgedünnt. „Zona thinning“ kann sowohl mit saurer Tyrode als auch mit einem Lasersystem durchgeführt werden. Ein Beispiel für laserassistiertes thinning ist in Abb. 3 gezeigt.

In Bezug auf „zona thinning“ wurde darauf hingewiesen, dass für den Erfolg des Verfahrens ein ausreichend großer Anteil der Zona ausgedünnt werden muss, um einen positiven Effekt bei der klinischen Anwendung zu erzielen (Mantoudis et al. 2001).

Eine weitere Technik zur möglichen Verbesserung der Implantation stellt die komplette Entfernung der Zona pellucida dar. Dies wurde nach Anwendung von Pronase bereits 1997 vorgestellt (Fong et al. 1997). Eine aktuelle Studie auf der Basis von Laser-AH zeigte an zuvor vitrifizierten Blastozysten, dass eine vollständige Entfernung der Zona pellucida unmittelbar nach dem Erwärmen im Vergleich zu einer partiellen Zona-Eröffnung signifikant höhere Hatchingraten unterstützt und die geschlüpften Blastozysten in vitro schneller auf Substraten anwachsen (Ueno et al. 2016).