Reproduktionsmedizin
Autoren
Markus Montag und Bettina Toth

„Assisted Hatching“

Die Eröffnung der Zona pellucida bei menschlichen Embryonen im Rahmen der assistierten Reproduktion ist eine etablierte Technik und wird insbesondere für Assisted Hatching und die Embryo- und Blastozystenbiopsie eingesetzt. Assisted Hatching soll es dem Embryo ermöglichen, zuverlässig aus der ihn umgebenden Zonahülle schlüpfen und anschließend implantieren zu können. Eine korrekte und zeitlich adaptierte Anwendung des Assisted Hatching ist Voraussetzung für das erfolgreiche Schlüpfen. Assisted Hatching kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden. Der Einsatz von kontakt-freien Lasersystemen hat sich durchgesetzt, um reproduzierbare Öffnungen zu erzeugen. Aufgrund klinischer Daten kann der Einsatz des AH bei Patientinnen mit wiederholtem Implantationsversagen und unter Berücksichtigung von Transfers mit kryokonservierten Embryonen empfohlen werden. Eine Steigerung der Erfolgsraten ist nur bei einem standardisierten Vorgehen zu erwarten.

Einleitung und Begriffsbestimmung

Während der frühen Teilungsstadien bis hin zur Blastozyste ist der menschliche Embryo von einer Hülle umgeben, der sog. Zona pellucida. Diese besteht beim Menschen aus 4 unterschiedlichen glykolisierten Proteinen, die eine extrazelluläre, multilaminäre Matrix aufbauen.
Die Zona pellucida schützt den Embryo vor einer Polyspermie, sowie bei der Passage durch den Eileiter. Weiterhin stellt sie eine Barriere dar, die den Transport von Molekülen oder Botenstoffen in beide Richtungen beeinflusst. Als Vorbedingung für die Implantation in das sekretorisch umgewandelte Endometrium muss der Embryo im Stadium der Blastozyste die ihn umgebende Zonahülle verlassen. Dieser Vorgang wird als „Schlüpfen“ bezeichnet und heißt übersetzt ins Englische „hatching“.
Definition „Assisted Hatching“ (AH)
Unter „Assisted Hatching“ versteht man die künstliche Eröffnung der Zona pellucida, um dem Embryo eine Hilfestellung beim „Schlüpfprozess“ zu geben. Hierzu wurden verschiedene Techniken zur kompletten Eröffnung oder partiellen Ausdünnung der Zona pellucida entwickelt. Unabhängig vom jeweils gewählten Verfahren kann AH nur im Rahmen einer künstlichen Befruchtung in vitro durchgeführt werden.
In diesem Beitrag werden zunächst die derzeitigen Kenntnisse über das Schlüpfen des Embryos in vivo und in vitro zusammengefasst, und die verschiedenen Methoden des AH werden illustriert dargestellt und beschrieben. Zudem wird die aktuelle Datenlage zu den Studienergebnissen des assistierten Schlüpfens vorgestellt und die sich daraus ableitenden Implikationen für die Anwendung in der täglichen Praxis zusammen gefasst.

Hatching in vitro und in vivo

Die Zona pellucida erfährt erste Veränderungen nach dem Eindringen des ersten Spermiums in die Eizelle. Mit dem sog. „Polyspermieblock“ wird das Eindringen von weiteren Spermien in die Eizelle weitgehend verhindert. Dies führt bis zum Vorkernstadium zu einer Verhärtung der Zona. Diese Veränderung dürfte aufgrund ihrer Bedeutung in vitro und in vivo gleichermaßen erfolgen. Im weiteren Verlauf bis hin zum Blastozystenstadium unterscheiden sich die Mechanismen in vivo und in vitro grundlegend.
In vitro beginnt mit dem Erreichen des Blastozystenstadiums eine zunehmende Raumforderung der expandierenden Blastozyste. Dadurch wird auf die sie umgebende Zona ein steigender Druck ausgeübt, welcher die Zona dehnt und gleichzeitig ausdünnt. Es handelt sich jedoch hierbei nicht um ein Ausdünnen als Ergebnis des Abbaus von Zonabestandteilen, vielmehr wird die Zona verdichtet und dadurch härter und spröder (Montag et al. 2000a). Um aus der Zona herauszuschlüpfen, unternimmt die Blastozyste mehrere Kontraktions- und Expansionsschritte. Gleichzeitig unterstützen einige (spezifische) Trophektodermzellen aktiv den Prozess des Schlüpfens (Sathananthan et al. 2003), vermutlich durch die Bereitstellung von lokal wirkenden Botenstoffen, die noch nicht näher charakterisiert sind.
Bezüglich der Situation in vivo kann derzeit nur auf die Kenntnisse von einigen wenigen tierexperimentellen Arbeiten zurückgegriffen werden. Diese Arbeiten belegen, dass beim Hamster und bei der Maus im Unterschied zum Menschen die Zona pellucida im Blastozystenstadium, solange sie vorhanden ist, keine Anzeichen einer Veränderung in Hinblick auf ihre Dicke zeigt (Gonzales und Bavister 1995; Montag et al. 2000b). Die Tatsache, dass die Zona von in vivo gewonnenen Embryonen sehr weich ist und innerhalb kürzester Zeit in utero aufgelöst wird, deutet auf eine direkte Beteiligung von Lysinen hin, welche eine enzymatische Auflösung der Zona in vivo nahelegen. In tierexperimentellen Untersuchungen konnten bisher jedoch in vivo keine expandierte Blastozysten mit einer sie umgebenden Zona aufgefunden werden.
Neben den kulturbedingten Veränderungen der Zona pellucida wird auch ein endokriner Einfluss insbesondere bei älteren Frauen oder bei Vorliegen eines erhöhten basalen FSH-Wertes diskutiert. Diese Argumente haben zu der Etablierung verschiedener Techniken des AH geführt, die im Folgenden im Detail beschrieben werden.

Techniken zur Eröffnung der Zona einschließlich Vor- und Nachteilen

Die verschiedenen Methoden des „Assisted Hatching“ dienen dazu, eine permanente Eröffnung oder partielle Ausdünnung in der Zona pellucida zu erzeugen. Die partielle Zonadissektion (PZD) und die laserbasierten Methoden haben ihren Ursprung in der Zeit vor Einführung der subzonalen Insemination (SUZI) und der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI). Sie wurden primär dafür verwendet, um bei eingeschränkten Spermaparametern den wenigen motilen Spermien einen Zugang zu der Eizelle zu ermöglichen und die Befruchtungsrate zu erhöhen (Gordon und Talansky 1986).

Partielle Zonadissektion (PZD)

Bei der PZD wird mit Hilfe einer spitzen Glaskapillare ein Schlitz in der Zona pellucida als permanente Öffnung erzeugt (Gordon und Talansky 1986). Das genaue Vorgehen ist in Abb. 1 illustriert. Diese Technik benötigt neben der erwähnten Glaskapillare die Zuhilfenahme einer Haltekapillare und wird in 2 aufeinander folgenden Manipulationsschritten ausgeführt.
Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie auf einer rein mechanischen Methode basiert. Jedoch besteht durch die Verwendung einer spitzen Kapillare und durch die auftretenden Scherkräfte die Gefahr, dass einzelne Blastomere des Embryos verletzt werden. Insbesondere können mit dieser Technik keine standardisierten Öffnungen mit einem definierten Durchmesser in der Zona pellucida erzeugt werden, sondern es wird vielmehr durch den Schlitz eine Schwachstelle innerhalb der Zona erzeugt, die der schlüpfende Embryo später bevorzugt nutzen kann.
Auch wenn die PZD historisch ihre Bedeutung hatte, so wird sie aktuell zum ausschließlichen Zweck des AH nicht mehr eingesetzt.

Saure Tyrode-Lösung

Der Einsatz einer sauren Tyrode-Lösung zur partiellen Eröffnung der Zona pellucida war eine der ersten Methoden, die ausschließlich für das AH entwickelt und angewandt wurden (Cohen et al. 1992). Saure Tyrode-Lösung hat einen pH-Wert von 2,5 und kann nur bei Embryonen eingesetzt werden, da eine Exposition von Eizellen mit dieser Lösung zu einer Beeinträchtigung bei der Embryonalentwicklung führen kann (Gordon et al. 1988). Insbesondere die später eingeführte Blastomerenbiopsie griff auf diese Technik zurück.
Die Anwendung dieses Verfahrens benötigt eine sehr große Erfahrung. Zunächst wird der Embryo derart an einer Haltekapillare fixiert, dass an der Stelle, die eröffnet werden soll, keine Blastomere mit direktem Kontakt zur Zona pellucida liegt. Mit einer zweiten Kapillare wird dann die saure Tyrode-Lösung auf die zu eröffnende Fläche aufgeblasen, wobei kontinuierlich die fortschreitende Auflösung der Zona pellucida kontrolliert werden muss. Sobald eine durchgehende Öffnung erzeugt ist, muss das Tyrode-haltige Medium sofort in die Applikationskapillare aufgezogen und der Embryo in eine neue Schale oder einen neuen Mediumtropfen umgesetzt werden.
Auch wenn dieses Verfahren in erfahrenen Händen gute Ergebnisse aufweist, so ist die Anwendung nicht ohne Risiken. Eine zu lange Exposition mit der sauren Tyrode-Lösung kann das Embryowachstum negativ beeinflussen und vermehrt zur Lyse von Blastomeren führen (Garrisi et al. 1990). Die Erzeugung von Zonaöffnungen mit einer definierten Größe ist mittels saurer Tyrode-Lösung nur schwer zu gewährleisten.

Pronase-Lösung

Die Inkubation von Embryonen in einer Pronase-Lösung führt zu einer gleichmäßigen Ausdünnung der Zona pellucida über die gesamte exponierte Oberfläche (Fong et al. 1997). Das Verfahren lässt sich kontrollierter durchführen als eine vergleichbare Behandlung mit Tyrode-Lösung. Es wird u. a. zum Transfer völlig zonafreier Blastozysten eingesetzt (Fong et al. 1997). Das Verfahren wird jedoch heute nur vereinzelt in Veröffentlichungen erwähnt.

Lasereinsatz

Seit Beginn der 1990er-Jahre wurden verschiedene Lasersysteme für das Eröffnen der Zona pellucida eingesetzt. Bei den ersten Lasern handelte es sich um Kontaktlaser, die nur an der direkten Kontaktstelle zur Zona pellucida eine lokal eng begrenzte Eröffnung erzeugen konnten. Das Laserlicht musste hierzu mittels spezieller Kapillaren appliziert werden, und die Prozedur erforderte neben einer Haltkapillare und einer Laserapplikationskapillare auch Mikromanipulatoren. Es kamen ursprünglich verschiedene Laserwellenlängen zum Einsatz, die jedoch z. T. in einem für lebende Zellen kritischen Bereich lagen. Der erste kommerzielle kontaktfrei arbeitende Stickstofflaser verwendete ebenfalls eine Wellenlänge im UV-Bereich und konnte zudem nur sehr kleine Öffnungen im μm-Bereich erzeugen, sodass eine hohe Anzahl von Laserpulsen mit entsprechender Energiedeposition benötigt wurde (Übersicht in Montag et al. 2000c).
Erst mit der Einführung eines 1,48-μm-Diodenlasers konnte sich die Lasertechnik als ein sicheres und einfach anzuwendendes Verfahren etablieren (Germond et al. 1995).
Die Sicherheit dieser Methode wurde in zahlreichen Publikationen belegt, und bis heute wurden nach zurückhaltenden Schätzungen mittels Laser-AH weltweit mehr als 100.000 Kinder geboren. Die Vorgehensweise beim laserassistierten Eröffnen der Zona pellucida ist in Abb. 2 gezeigt.
Alle derzeit gebräuchlichen kontaktfreien Lasersysteme können für die verschiedensten Anwendungen bei sachgemäßer Anwendung und entsprechender Expertise eingesetzt werden. Die Einfachheit des Verfahrens birgt jedoch das Risiko eines undifferenzierten Vorgehens mit u. U. problematischen Folgeerscheinungen. Prinzipiell führt eine künstlich erzeugte Öffnung dazu, dass der Embryo, sobald er innerhalb der ihn umgebenden Hülle eine Raumforderung kreiert, seitens der eröffneten Zona keinen Widerstand erfährt und somit die vorhandene Öffnung zum Schlüpfen benutzt. Daher kann man bei der Zona dieser Embryonen nach AH im weiteren Verlauf der Entwicklung und bei beginnender Expansion des Embryos kein weiteres Ausdünnen der Zona mehr erkennen. Stattdessen schlüpft der Embryo direkt durch die Öffnung, die durch das AH in der Zona geschaffen wurde. Der Zeitpunkt, zu dem der Prozess des Schlüpfens startet, ist dabei direkt von der Anzahl an verfügbaren Zellen des Embryos abhängig (Montag et al. 2000b).
Allerdings nutzt der Embryo auch alle ihm zur Verfügung stehenden Öffnungen für den Prozess des Ausschlüpfens. Werden beispielsweise zwei räumlich getrennte Öffnungen in der Zona erzeugt, so werden auch beide Öffnungen für das spätere Ausschlüpfen benutzt, und somit besteht eine nahezu 100 %-ige Chance, dass dieser Embryo letztendlich verkümmert.
Gleichermaßen bedeutsam ist die Größe der erzeugten Öffnung: Sobald diese einen bestimmten Durchmesser unterschreitet, besteht die Gefahr, dass der Embryo die Zona beim Schlüpfen nicht komplett verlassen kann und infolgedessen degeneriert.
Die hier skizzierten Probleme wurden in den 1990er-Jahren tierexperimentell untersucht, und auf ihre Bedeutung für eine erfolgreiche Applikation des AH wurde bereits damals hingewiesen (Montag und van der Ven 1999; Schmoll et al. 2003).
Cave
Es muss insbesondere erwähnt werden, dass bei der Verwendung des Lasers für andere Einsatzgebiete (z. B. Polkörper- oder Embryobiopsie) diese grundlegenden Regeln des Lasereinsatzes beachtet werden müssen, um einen negativen Effekt aufgrund einer unsachgemäßen Zonaeröffnung zu vermeiden.

„Zona Thinning“ und „Zona Removal“, Weiterentwicklungen des AH

Eine Weiterentwicklung des AH führte zu dem sog. „zona thinning“ (Blake et al. 2001). Hierbei wird keine durchgehende permanente Öffnung erzeugt, vielmehr wird die Zona pellucida über eine größere Strecke hinweg ausgedünnt. „Zona thinning“ kann sowohl mit saurer Tyrode als auch mit einem Lasersystem durchgeführt werden. Ein Beispiel für laserassistiertes thinning ist in Abb. 3 gezeigt.
In Bezug auf „zona thinning“ wurde darauf hingewiesen, dass für den Erfolg des Verfahrens ein ausreichend großer Anteil der Zona ausgedünnt werden muss, um einen positiven Effekt bei der klinischen Anwendung zu erzielen (Mantoudis et al. 2001).
Eine weitere Technik zur möglichen Verbesserung der Implantation stellt die komplette Entfernung der Zona pellucida dar. Dies wurde nach Anwendung von Pronase bereits 1997 vorgestellt (Fong et al. 1997). Eine aktuelle Studie auf der Basis von Laser-AH zeigte an zuvor vitrifizierten Blastozysten, dass eine vollständige Entfernung der Zona pellucida unmittelbar nach dem Erwärmen im Vergleich zu einer partiellen Zona-Eröffnung signifikant höhere Hatchingraten unterstützt und die geschlüpften Blastozysten in vitro schneller auf Substraten anwachsen (Ueno et al. 2016).

Aktuelle Datenlage

„Assisted Hatching“ wurde von Anbeginn bei den verschiedensten Indikationen angewandt (Übersicht).
Indikationen des „Assisted Hatching“
  • Alter 37 Jahre
  • Erhöhter basaler FSH
  • Schlechte Embryoqualität
  • Kryotransferzyklen
  • Eizellen mit einer auffallend breiten Zona pellucida
Zu allen genannten Indikationen findet man Studien, die einen Vorteil des AH belegen, aber auch solche, die genau das Gegenteil beweisen.
Auch mehr als 20 Jahre nach Einführung des Verfahrens wird der effektive Nutzen des AH nach wie vor kontrovers diskutiert.
Im aktuellen Cochrane Review zum AH wird ausdrücklich auf die Heterogenität der Studien hingewiesen und die daraus resultierende Problematik bei der Erstellung einer validen Metaanalyse erörtert (Carbney et al. 2012). Fasst man alle Studien zusammen, so ergibt sich für AH hinsichtlich der Geburtenrate derzeit kein signifikanter Vorteil. Werden nur die methodisch „robusten“ Studien berücksichtigt, so konnte eine Steigerung der klinischen Schwangerschaftsrate beobachtet werden, wobei sich insbesondere in Subgruppen-Analysen signifikante Verbesserungen nach vorausgegangener, erfolglosen IVF-Behandlung ergaben. Für AH wurde eine signifikant höhere Mehrlingsrate dokumentiert (Carbney et al. 2012). Ähnliche Ergebnisse wurden bereits zuvor in einem systematischen Review mit Metaanalyse berichtet (Martins et al. 2011) und in einem begleitenden Editorial kommentiert (Van Wely und van der Veen 2011).
Dass das methodische Vorgehen bei AH einen Einfluss auf die Ergebnisse haben kann, soll am Beispiel der sog. rezidivierenden Implantationsversager („recurrent implantation failure“; RIF) aufgezeigt werden (Farquharson et al. 2005). RIF tritt bei etwa 2–3 % der Kinderwunschpatientinnen auf. Die Definition umfasst das Nichteintreten einer Schwangerschaft nach 3-maligem Transfer von einem oder mehreren Embryonen von „guter Qualität“ bzw. nach dem erfolglosen Transfer von >10 Embryonen in multiplen Transfers (Margalioth et al. 2006). Die RIF-Patientengruppe war bereits in einer Metaanalyse von 2003 die einzige Gruppe, bei der AH einen Vorteil hinsichtlich der Schwangerschaftsrate zeigte (Edi-Osagie et al. 2003).
In einer Studie untersuchten Valojerdi und Mitarbeiter den Benefit eines lasergestützten AH bei 410 älteren IVF/ICSI-Patientinnen (>37 Jahre), 180 Frauen mit einem Kryotransfer und 796 RIF-Patientinnen (≥2 erfolglose Zyklen) (Valojerdi et al. 2008). Jede Studiengruppe wurde hälftig geteilt in Frauen mit und ohne AH. Eine signifikant höhere Implantationsrate im Vergleich zur Kontrollgruppe wurde nur in der Gruppe mit einem Kryotransfer gefunden, nicht jedoch bei den RIF-Patientinnen. Allerdings wurden in dieser Arbeit mit dem Laser sehr große Öffnungen erzeugt (>40 μm).
Hingegen belegte eine prospektiv randomisierte europäische Multicenterstudie zum Laser-AH mit Öffnungen um 20–25 μm einen Vorteil für RIF-Patientinnen (Primi et al. 2004), und auch eine neue Studie zum „zona thinning“ sieht bei RIF-Patientinnen eine Indikation für AH (Petersen et al. 2005).
Diese Beispiele belegen, dass die Durchführung des AH ausschlaggebend für einen Vorteil der Methode ist. Selbst kleine Veränderungen wie die Größe der erzeugten Öffnungen können einen negativen Einfluss auf die Ergebnisse haben. Insofern könnte sich das „zona thinning“ als die effizientere AH-Methode erweisen, da hier eine gute Standardisierung möglich ist.
Generell hat die Durchführung des laser-assistierten AH an menschlichen Embryos keine negativen Auswirkungen auf die Embryonen (Zhou et al. 2014; Uppangala et al. 2016). Im Vergleich mit einer großen externen Kontrollgruppe (Kinder nach spontaner Konzeption) konnte nach Laserbehandlung keine Erhöhung der Häufigkeiten leichter und schwerer angeborener Fehlbildungen festgestellt werden (Kanyó und Konc 2003).

Fazit

Der Einsatz des AH kann derzeit nur bei Patientinnen mit wiederholtem Implantationsversagen unter Berücksichtigung von Transfers mit kryokonservierten Embryonen empfohlen werden. Eine Steigerung der Erfolgsraten ist nur bei einem standardisierten Vorgehen zu erwarten.
Das Verfahren der Wahl ist das Ausdünnen der Zona pellucida („zona thinning“) über mindestens ¼ des Umfangs.
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