Verbesserte Qualität gelagerter Erythrozytenkonzentrate durch maschinelle Autotransfusion

Es gibt in der Literatur mehrere Ansätze zur Nachbehandlung von gelagerten EK, um die negativen Effekte der nichtvermeidbaren Lagerungsschäden zu reduzieren. Neben verschiedenen neuartigen Additivlösungen steht die MAT-Behandlung vor einer Transfusion zur Verfügung. Für die EK-Vorbehandlung wurden von verschiedenen Autoren alternative Waschlösungen getestet. Yang et al. versuchten eine Mannitol-Adenin-Phosphat-Lösung zur Waschung und zur Stabilisierung [7]. Die von ihnen verwendete Stabilisatorlösung konnte das bearbeitete EK u. a. länger haltbar machen. Huber et al. wählten erstmals den Ansatz einer „bikarbonatgepufferten“ Hämofiltrationslösung ohne Kalium zur MAT-Behandlung von EK mit ausschließlich positivem Effekt [8]. Gezeigt werden konnte, dass es neben der Verbesserung des Säure-Base-Haushaltes im Lagermedium zu einer verbesserten Stabilität der Erythrozyten kam.

In Bezug auf die erforderliche Elektrolytzusammensetzung für eine Volumentherapie sind aktuell zwei Richtlinien von klinischer Bedeutung. Zum einen die aktuelle S3-Leitlinie zur intravasalen Volumentherapie bei Erwachsenen, zum anderen die S1-Leitlinie perioperative Infusionstherapie bei Kindern. Beide Leitlinien empfehlen grundsätzlich die Verwendung von balancierten Vollelektrolytlösungen zur Volumentherapie [9, 10].

Den gesetzlichen Rahmen für die Transfusion von Erythrozytenkonzentraten bildet das Transfusionsgesetz [11]. Hierin wird neben allgemeinen Regelungen des Transfusionswesens auf die Details in Richtlinien nach §§ 12a und 18 TFG verwiesen. In der entsprechenden Hämotherapie-Richtlinie von 2017 haben die Bundesärztekammer und die zuständige Bundesoberbehörde, das Paul-Ehrlich-Institut (PEI), im Abschnitt 3.2.1.3 die Anforderungen an das Waschen gelagerter EK näher definiert [1]. Das Aufbereiten eines gelagerten EK hat in einem geschlossenen System zu erfolgen. Als Lagermedium nach dem Aufbereiten mit 0,9 %iger NaCl-Lösung sind auch Additivlösungen erlaubt. Gewaschen werden dürfen nur EK, die den allgemeinen Anforderungen der Richtlinie entsprechen. Die anschließende Lagerungsdauer hängt von der durchgeführten Validierung des Prozesses ab, in dem der Hämatokrit, das Gesamt-Hb, die Hämolyserate und der Proteingehalt bestimmt werden. Darüber hinaus muss eine mikrobiologische Kontrolle durchgeführt werden.

Aus dem Metabolismus der Erythrozyten erklärt sich ihre Schädigung durch die Lagerung. In der Zellreifung präzipitieren die Mitochondrien. Durch den funktionellen Verlust der Mitochondrien stehen der kernlosen Zelle β‑Oxidation, der Zitratzyklus und die Atmungskette zur Energiegewinnung nicht mehr zur Verfügung. Die anaerobe Glykolyse wird zur Energiegewinnung herangezogen. Diese führt zum Endprodukt Lactat, das in vivo außerhalb der Erythrozyten weiterverstoffwechselt werden kann, sich im Blutbeutel aber kumuliert und zur zunehmenden Ansäuerung im EK führt. Hierdurch kommt es zum Nachlassen der Glykolyse; dies führt zu einer verringerten Verfügbarkeit von ATP. Aus dem ATP-Mangel resultiert, dass der aktive Ionentransport nicht mehr vollumfänglich gewährleistet werden kann. Hieraus ergeben sich intrazellulär ein verminderter Kaliumgehalt sowie eine erhöhte Natrium- und Kalziumkonzentration. Darüber hinaus nimmt durch den ATP-Mangel die Synthese bzw. die Reduktion von Glutathion ab. Das Tripeptid ist Hauptbestandteil des Glutathionredoxsystems. In seiner reduzierten Form schützt es die Sulfhydrylgruppen von Enzymen, Proteine der Erythrozytenmembran und das Hämoglobin vor der Oxidation. Insgesamt bleibt allerdings die antioxidative Kapazität während der ganzen Lagerungsdauer ausreichend [12]. Neben diesen genannten Effekten kann es im Laufe der Alterungs- und Lagerungszeit auch zu einer Zunahme von intrazellulärem Wasser kommen, wodurch die Hämoglobinkonzentration in der Zelle sinkt und die wichtige Deformierbarkeit abnimmt. Zusätzlich wechselt Phosphatidylserin die Position von der Innenseite zur Außenseite und ist somit Angriffspunkt für Makrophagen. Wegen der genannten Zusammenhänge wird die ATP-Konzentration für die qualitative Beurteilung von EK herangezogen. Heiden et al. definieren die ATP-Konzentration sogar als den wichtigsten Surrogatmarker für die Überlebenswahrscheinlichkeit gelagerter Erythrozyten im Transfusionsempfänger [13].

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Fragestellung der Qualitätsverbesserung gelagerter Erythrozytenkonzentrate (EK) mittels eines maschinellen Autotransfusionsgerätes. Untersucht wurde, ob die Wahl der verwendeten Waschlösung bei der maschinellen Autotransfusion einen Einfluss auf die Qualität der Erythrozyten hat und das aufbereitete EK dadurch verbessert wird.

Im Rahmen der Studie wurden mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt. Hierzu wurden zu den Messzeitpunkten EKprä, EKpost und EKpost24h aus dem bei Raumluft gelagerten Retransfusionsbeutel je 16 ml aufbereitetes EK entnommen. Zur Beimpfung der aeroben und anaeroben Blutkulturflaschen wurden hierbei jeweils 8 ml EK/Kulturflasche benötigt.

Die statistische Auswertung erfolgte mit SPSS für Windows (Version 21 SPSS Inc., USA). Der Test auf Normalverteilung erfolgte mittels Q‑Q-Plot. Die gemessenen Werte zu einem bestimmten Messzeitpunkt wurden mittels Welch t-Test ausgewertet. Die Analyse zwischen den einzelnen Messzeitpunkten erfolgte mittels gepaartem t-Test. Alle ermittelten Werte sind in der Form Mittelwert ± einfache Standardabweichung angegeben. Das Signifikanzniveau betrug α = 0,05.

Der ATP-Gehalt aller EK nimmt von Messpunkt EKprä zu EKpost signifikant zu (n = 30; EKprä: 3,1 ± 0,7 µmol/gHb vs. EKpost: 3,8 ± 0,7 µmol/gHb; p < 0,05). Die Abb. 2 zeigt die ATP-Konzentration nach dem Prozessieren und der 10-stündigen Lagerung, unterteilt nach der jeweils verwendeten Waschlösung. In der Gruppe der 37 Tage alten EK nimmt die ATP-Konzentration in der HF-Gruppe im Verhältnis zur N‑Gruppe signifikant zu (EKpost vs. EKpost10h: 3,7 ± 0,4 vs. 4,0 ± 0,5 µmol/gHb; p < 0,05).

Zum Zeitpunkt EKprä lagen alle gemessenen Elektrolyte (Na, K, Cl und Ca) unabhängig von der Lagerungsdauer in unphysiologischen Konzentrationsbereichen (EKprä) (Abb. 3). In den EK der HF-Gruppe liegen alle Elektrolyte nach dem Waschen (EKpost) in einem physiologischeren Bereich. Der Messzeitpunkt EKpost zeigt in der N‑Gruppe im Vergleich zur HF-Gruppe einen signifikanten Unterschied bezogen auf die Natrium- (154 mmol/l vs. 136 mmol/l) und Chloridkonzentration (135 mmol/l vs. 103 mmol/l). In der HF-Gruppe nimmt die Natriumkonzentration zwischen den Zeitpunkten EKpost und EKpost10h signifikant auf physiologische Werte zu (Na = 140 mmol/l), während sie in der N‑Gruppe auf einem unverändert unphysiologischen hohen Niveau bleibt. Die Ausgangskaliumkonzentration, die über die Lagerdauer (EKprä) zunimmt, sinkt durch die MAT (EKpost) in beiden Gruppen signifikant. Im physiologischen Referenzbereich liegt die HF-Gruppe zum Zeitpunkt EKpost mit 4,1 mmol/l, während die N‑Gruppe diesen mit 0,4 mmol/l unterschritt. In der HF-Gruppe führt die offensichtlich funktionierende Natrium-Kalium-Pumpe in den Erythrozyten bis zum Zeitpunkt EKpost10h zu einer signifikanten Abnahme der Kaliumkonzentration (3,5 mmol/l). Die Kalziumkonzentration in den gelagerten EK (EKprä) war unabhängig von der Lagerungszeit mit < 0,2 mmol/l sehr niedrig. Zum Messzeitpunkt EKpost und EKpost10h konnte kein Kalzium mehr in der N‑Gruppe nachgewiesen werden. In der HF-Gruppe kam es zu einem signifikanten Anstieg nach dem Waschen und einem weiteren Anstieg bis zu EKpost10h (Abb. 3).

Die unphysiologische Glucosekonzentration in gelagerten EK vor MAT-Waschung ist von der Lagerungsdauer abhängig und konnte in der N‑Gruppe fast vollständig durch die MAT-Behandlung ausgewaschen werden (11 mg/dl). In der HF-Gruppe kam es zum Zeitpunkt EKpost zu einer Reduktion der Glucose auf ein physiologisches Niveau (95 mg/dl). Durch den noch funktionierenden Metabolismus der Erythrozyten kam es zu einer weiteren signifikanten Reduktion in der HF-Gruppe auf 67 mg/dl vs. 1 mg/dl in der N‑Gruppe (Abb. 4). Die Lactatkonzentration nimmt über die Lagerungszeit signifikant zu und nimmt durch die MAT wieder signifikant ab. Nach 10 h Lagerung liegt in der HF-Gruppe eine signifikant höhere Konzentration vor (Abb. 4).

pH-Wert, HCO₃⁻ und BE nehmen über die Lagerungszeit (7 bis 37 Tage) signifikant (p < 0,05) ab, bei signifikant höherem pCO₂ (p < 0,05). Betrachtet man den pH-Wert nach der MAT-Aufbereitung bezogen auf die Waschlösung, stellt man fest, dass in der HF-Gruppe insgesamt ein höherer pH-Wert unabhängig von der Lagerzeit auftritt (N-Gruppe vs. HF-Gruppe: pH-Wert EKpost: 6,50 vs. 6,89) und nur leicht über die post-MAT Lagerzeit abnimmt (EKpost10h: 6,43 vs. 6,81) (Abb. 5). Bezogen auf den pCO₂ und BE wurde sowohl zum Zeitpunkt EKpost als auch zum Zeitpunkt EKpost10h in der HF-Gruppe signifikant erhöhte pCO₂-Werte bei sinkenden BE und in der N‑Gruppe ein gegensätzliches Verhalten festgestellt. Im Mittel, über alle EK (n = 30), sehen wir einen HCO₃⁻-Wert von 12 mmol/l. Waschlösungsbedingt verändert sich der HCO₃⁻ nach der Aufbereitung (EKpost) signifikant unterschiedlich (N-Gruppe vs. HF-Gruppe: HCO₃⁻-Wert: 6 mmol/l vs. 24 mmol/l) (Abb. 5).

Die mittlere Zitratkonzentration im Lagermedium bei 30 EK betrug 2,72 ± 0,44 mmol/l zum Messzeitpunkt EKprä. Die Konzentration zum Messzeitpunkt EKpost nach MAT-Behandlung betrug unabhängig von der Waschlösung 0,0 mmol/l.

In den insgesamt 180 Blutkulturen wurden zu bei acht verschiedenen Proben unterschiedlichen Zeitpunkten Hautkeime (Cutibacterium acnes; Staphylococcus haemolyticus; Microbacterium aurum; Corynebacterium simulans) gefunden.

Durch das Waschen eines EK erfolgt eine Veränderung der Elektrolytzusammensetzung vom „ursprünglichen“ zum „neuen“ Lagermedium. Dabei ist die Art der verwendeten Waschlösung bestimmend für die Elektrolytzusammensetzung im Retransfusionsbeutel. Die Verwendung einer Hämofiltrationslösung führt aufgrund ihrer Zusammensetzung zur Abnahme von elektrolytassoziierten Nebenwirkungen. Vergleicht man die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Waschlösungen in Bezug auf Natriumionen, fällt die unphysiologisch hohe Na-Konzentration der Waschlösung in der N‑Gruppe mit 154 mmol/l vs. 140 mmol/l in der HF-Gruppe auf. Nach dem Waschen des Blutes zeigt sich, dass alle gemessenen Elektrolyte nur in der HF-Gruppe in einem physiologischen Bereich liegen. Die negativen Einflüsse nach Massivinfusion mit (un)physiologischer Kochsalzlösung kann die Plasmaionenkonzentration von Na⁺ und Cl⁻ erhöhen, sodass eine metabolische Acidose die Folge ist [3]. Diese kann zu einer renalen Vasokonstriktion mit verminderter Diurese und einer akuten Niereninsuffizienz (ANI) führen [32]. Ursächlich für eine ANI könnte hierbei ein erhöhte Chloridkonzentration der transfundierten Kochsalzlösung sein. Proffitt et al. konnten bei 14 Tage alten EK, die mit 0,9 %iger NaCl-Lösung gewaschen wurden, eine signifikant höhere Hämolyserate im Vergleich zu EK, die mit SAGM gewaschen wurden, feststellen [33].

In den Ergebnissen der 180 Blutkulturen wurden 8 positive Keimnachweise gefunden. Verunreinigungen durch die Behandlung der EK mit MAT konnten nicht nachgewiesen werden. Zur Beimpfung der aeroben und anaeroben Blutkulturflaschen wurden die Kappe der Kulturflasche ohne Handschuhe geöffnet und mit Blut aus dem Retransfusionsbeutel befüllt. Hierbei dürften Hautkeime vom Laborpersonal übertragen worden sein. Das gefundene Keimspektrum zeigte ausnahmslos Hautkeime. Es gab kein einziges EK, in dem sich bei weiterführenden Messzeitpunkt des gleichen Retransfusionsbeutel positive Keimnachweise fanden. Da kein weiteres Keimwachstum nachweisbar war, ist in jedem Fall einer positiven mikrobiologischen Kontrolle von unsachgemäßer Handhabung beim Beimpfen der Kulturflaschen auszugehen.

Arzneimittelrechtlich wirft das Waschen von homologen EK mittels einer MAT-Maschine unmittelbar vor dem Priming einer Herz-Lungen-Maschine mit den so gewonnenen gewaschenen EK in Deutschland Probleme auf. Auch bei Verwendung zugelassener und vom Hersteller in Verkehr gebrachter EK stellt jeder nachgelagerte Bearbeitungsschritt, sei es Teilung, Bestrahlung oder eben Waschen, einen Schritt dar, der den weit gefassten Begriff Arzneimittelherstellung im Sinne von § 4 Abs. 14 AMG anwendbar macht. Da es sich im beschriebenen Kontext um eine patientenbezogene gerichtete Herstellung handelt und kein Inverkehrbringen seitens der Person, die die MAT durchführt, vorliegt, wenn sie selbst die entstehenden gewaschenen EK zum Priming einsetzt, ist eine Herstellungserlaubnis nach § 13 AMG nicht erforderlich. Sehr wohl unterliegt die Tätigkeit aber der allgemeinen Anzeigepflicht nach § 67 AMG. Offen ist aus unserer Sicht dagegen, ob die beschriebene Tätigkeit des Waschens homologer EK per se eine Spendeeinrichtung im Sinne von § 2 Nr. 1 TFG eröffnet. Diese Frage stellt sich natürlich nicht, wenn die Einrichtung auch die klassische MAT als fremdblutsparendes autologes Hämotherapieverfahren einsetzt, wovon in der Regel auszugehen sein dürfte. Gerade dann ist aber die Frage, ob der Qualifikationsnachweis des Facharztes für Anästhesiologie als leitende ärztliche Person i. S. v. § 4 S. 1 Nr. 2 TFG, den Abschnitt 2.6.4 der Richtlinie Hämotherapie erlaubt, auch diese Sonderanwendung der MAT abdecken kann [1]. Da unseres Erachtens die aktuellen Fassungen von AMG, TFG und Richtlinie Hämotherapie keine zweifelsfreie Antwort geben, dürfte die zuständige Aufsichtsbehörde einen Ermessensspielraum haben.

Hierbei sollte berücksichtigt werden, dass derzeit keine gute Alternative zur Vermeidung lebensgefährlicher Arrhythmien in der Kinderherzchirurgie durch anflutendes Kalium aus zum Priming der Herz-Lungen-Maschine eingesetzten EK vorhanden ist. Die systematische Bestellung gewaschener EK von versorgenden Spendediensten als Alternative beinhaltet erhebliche Probleme hinsichtlich Logistik und zeitnaher Bereitstellung benötigter Präparate.

Erythrozyten Konzentrate werden in der Regel in weichmacherhaltigen PVC-Lagerbeuteln bei 4 °C aufbewahrt. Mehrere Studien konnten nachweisen, dass durch das Waschen von EK mittels MAT unabhängig von der Waschlösung der primäre Weichmacher (DEHP) sowie sein direkter Metabolit (MEHP) signifikant reduziert werden konnten [34, 35]. Bezogen auf die Elimination von Heparin aus der MAT-Spüllösung konnten Kwapil et al. feststellen, dass beim Waschen von EK eine um 99,6 %ige Reduktion des initial zugesetzten Heparins (25000 IE) erzielt werden konnte. Die Arbeitsgruppe konnte somit nachweisen, dass die Restheparinmenge pro transfundiertem Volumen unterhalb einer therapeutischen Wirksamkeit liegt [36]. Durch die MAT kommt es zur vollständigen Elimination von Zitrat, welches dem „ursprünglichen“ Lagermedium zugesetzt wurde. Die Zitratelimination bietet den Vorteil, dass keine Metabolisierung in der Leber stattfindet und das Risiko einer Posttransfusionsalkalose minimiert ist [18].

Die Verwendung von 150 mm Hg Vakuum muss als Limitation der Studie betrachtet werden. Durch diesen Unterdruck kann es zu Hämolyse durch die hohen Scherkräfte beim Einsaugen ins Reservoir kommen. Die Schwelle des negativen Drucks beträgt laut Jegger et al. 120 mm Hg [37]. Bezogen auf das gewaschene Endprodukt im Retransfusionsbeutel, solle diese Limitation ohne Bedeutung sein, da das freie Hb durch das Waschen signifikant gesenkt wird [25].

Beim Beimpfen der Kulturflaschen zur mikrobiologischen Beurteilung der MAT-Waschung kam es in 4,4 % der Fälle zu laborpersonalbedingten Verunreinigungen.