Immunelektrophorese, zweidimensionale nach Clarke und Freeman
Verfasst von: R. Westermeier
Immunelektrophorese, zweidimensionale nach Clarke und Freeman
Synonym(e)
Kreuzimmunelektrophorese
Englischer Begriff
crossed immunoelectrophoresis according to Clarke and Freeman
Definition
Bei der zweidimensionalen Immunelektrophorese nach Clarke und Freeman erfolgt erst eine elektrophoretische Trennung eines Proteingemisches in einem Agarosegel (s. Agarosegelelektrophorese). Die Trennspur wird ausgeschnitten und an eine Antikörpergemisch-haltige Agarosegelschicht angegossen. Dann lässt man die getrennten Fraktionen elektrophoretisch in das Antikörpergemisch-haltige Agarosegel einwandern. An den Positionen von Antigenen entstehen raketenförmige Präzipitatbögen, deren Integralflächen proportional zu den jeweiligen Antigenmengen sind.
Physikalisch-chemisches Prinzip
Die zweidimensionale Immunelektrophorese nach Clarke und Freeman ist eine Kombination einer elektrophoretischen Trennung mit einer Elektroimmundiffusion, auch Raketentechnik genannt. Sie wird verwendet als qualitative und zugleich quantitative Analysemethode für Antigengemische. Im Gegensatz zur eindimensionalen Immunelektrophorese nach Grabar und Williams (Immunelektrophorese, eindimensionale nach Grabar und Williams) verwendet man 2 verschiedene Gele. Normalerweise ist die erste Dimension eine Agarosegelelektrophorese; es können auch andere, hochauflösendere Methoden angewandt werden wie die Isoelektrische Fokussierung im Agarose- oder Polyacrylamidgel. Nach der Trennung in der ersten Dimension wird die Trennspur ausgeschnitten und auf eine Glasträgerplatte gelegt. Nachdem zu einem 55 °C warmen Agarosesol das Antikörpergemisch zugegeben wurde, wird es an den Elektrophoresegelstreifen angegossen (Abb. 1).
Abb. 1
Schematische Darstellung der Technik: nach einer Agarosegelelektrophorese werden die einzelnen Trennspuren ausgeschnitten und an ein Agarosegel angegossen, das multispezifisches Antiserum enthält. Die elektrophoretisch einwandernden Antigene bilden mit dem gegen sie gerichteten Antikörper jeweils einen Präzipitatpeak
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Hierbei gelten die gleichen Regeln wie bei der Elektroimmundiffusion nach Laurell. Man lässt nun bei niedriger Feldstärke die Antigenfraktionen in das Antikörpergel einwandern. An den Äquivalenzpunkten bilden sich zwischen Antigenen und Antikörper unlösliche Immunkomplexe in der Form von Raketen aus (s. folgende Abbildung).
Beispiel der Auftrennung von Humanserum gegen multispezifisches Antiserum:
Ursprünglich wurde Tris-Barbituratpuffer pH 8,6 verwendet. Wegen des Betäubungsmittelgesetzes (s. Betäubungsmittelgesetz) bekommt man nur noch sehr schwer Zugang zu Barbitursäure. Deshalb wird heutzutage meist ein Tris-Tricin-Calciumlactat-Puffer eingesetzt.
Die Präzipitatbögen werden mittels Coomassie-Färbung detektiert. Streng genommen ist das Integral der Präzipitatbogenflächen proportional zur jeweiligen Antigenmenge. Zur Vereinfachung der Methode wird aber meist die Peakhöhe der Bögen verwendet; dies kommt dem Flächenwert sehr nahe. Zur Quantifizierung von Antigenen wird eine Verdünnungsreihe analysiert und eine Kalibrationskurve erstellt.
Von dieser Technik gibt es einige spezielle Varianten:
Bei der Tandem-Kreuzimmunelektrophorese wird ein gereinigtes Protein (Antigen) in ein zweites Loch hinter der Probe aufgetragen und ebenfalls aufgetrennt (s. folgende Abbildung, Punkte 1 und 2). Dieses wandert im konstanten Abstand dem entsprechenden Antigen in der Probe voraus (wie bei einem Tandem) und bildet in der zweiten Dimension ebenfalls eine Präzipitatrakete mit dem Antikörper im entsprechenden Abstand (s. folgende Abbildung, Peaks a und b). Auf diese Weise kann ein Antigen identifiziert und quantifiziert werden.
Bei der Zwischengel-Kreuzimmunelektrophorese wird ein Gelstreifen mit monospezifischem Antikörper zwischen Elektrophoresegel und multispezifischem Antikörpergel eingegossen. Bei der Wanderung in der zweiten Dimension beginnt sich der Präzipitatpeak des „gesuchten“ Antigens bereits in der Zone des Zwischengels auszubilden, während die anderen Präzipitatpeaks erst hinter dem Zwischengel beginnen.
Die Fused-rocket-Immunelektrophorese ist eine zweidimensionale Technik mit einer Trennung im flüssigen Medium in der ersten Dimension. Hierbei werden in einen Gelstreifen Löcher in Zickzackform versetzt eingestanzt. Die Probenfraktionen aus z. B. einer Flüssigchromatografie werden nacheinander in die Löcher einpipettiert. Man lässt die Proben ineinander diffundieren, schneidet dann den Gelstreifen ab und verfährt wie oben bei der Immunelektrophorese nach Clarke und Freeman beschrieben. Wegen der Diffusionsphase wird ein Antigen, das auch in benachbarten Fraktionen vorhanden ist, mit diesen einen gemeinsamen Peak bilden.
Die folgende Abbildung zeigt ein Beispiel einer Tandem-Kreuzimmunelektrophorese von Humanserum. Gereinigtes Transferrin wurde in ein versetzt gestanztes Loch (2) in der Elektrophorese mit aufgetrennt. In der zweiten Dimension bildet sich im Abstand des zweiten Lochs ein zweiter Peak (b) des gesuchten Antigens (a) aus:
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Einsatzgebiet
Die Einsatzgebiete sind vielfältig, beispielsweise:
Qualitative und quantitative Untersuchungen auf Vorhandensein bestimmter Proteine und deren Mengen
Die Empfindlichkeit liegt im Allgemeinen im μg-Bereich der Antigenkonzentrationen. Die Empfindlichkeit der Coomassie-gefärbten Immunpräzipitate liegt bei 18 ng/mm2.
Fehlermöglichkeit
Es gibt eine Reihe von Fehlermöglichkeiten: Keine oder die falschen Antikörper werden verwendet, das Antigen-Antikörper-Verhältnis ist inkorrekt, die Feldstärke ist zu hoch gewählt, der Antikörper ist polyvalent. Bei der Quantifizierung wurde extrapoliert; korrekt ist interpolieren innerhalb der Kalibrationskurve.
Praktikabilität – Automatisierung – Kosten
Fertiggele werden nicht angeboten, unter anderem weil antikörperhaltige Gele verwendet werden. Automatisierung ist kaum möglich. Die Kosten sind wegen der großen Mengen an Antikörpern relativ hoch.
Literatur
Clarke HGM, Freeman T (1968) Quantitative immunoelectrophoresis of human serum proteins. ClinSci 35:403–413
