Kryokonservierung

Das traditionell langsame Einfrieren („slow freezing“) beinhaltet das langsame kontrollierte Einfrieren, welches bei relativ niedrigen Konzentrationen der Kryoprotektiva den Austritt des intrazellulären Wassers aus den Zellen während der Prozedur ermöglicht.

Bis zu einer Temperatur von −5 °C sind die Zellen und das umgebende Medium ungefroren und unterkühlt („supercooled“). Zwischen −5 und −10 °C bildet sich im umgebenden Medium Eis (entweder spontan oder als Folge des Seedings der Lösung). Die Einfrierverfahren zielen darauf ab, die intrazelluläre Kristallisation zu vermeiden, die die Zellen zerstören und deren Avitalität verursachen würde.

Wenn die Abkühlung langsam abläuft, verlässt das Wasser die Zelle schnell genug, um eine Konzentration der intrazellulären Lösungen zu erreichen. Die Zellen dehydrieren, und die intrazelluläre Eisbildung wird verhindert.

Erfolgt die Abkühlung aber zu langsam, schrumpfen die Zellen stark und sind den erhöhten intrazellulären Konzentrationen zu lange ausgesetzt. Beide Phänomene können eine Zellschädigung verursachen.

Das traditionell langsame Einfrieren, auch als „equilibrium freezing“ bezeichnet, beinhaltet die Äquilibrierung der Zellen in relativ niedrigen Kryoprotektiva-Konzentrationen (ca. 1,5 M) sowie die Dehydrierung während des Einfrierens bei langsamen, genau festgelegten Kühlraten (0,3–2 °C/min). Diese Methode wurde zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen erstmals erfolgreich angewendet (Whittingham et al. 1972). Erst 1977 allerdings berichtete Whittingham über die erste Geburt nach Kryokonservierung von Mäuseoozyten in flüssigem Stickstoff bei −196 °C.

Kryoprotektiva können durch direkte (permeable Kryoprotektiva) oder osmotische Einflüsse (nicht permeable Kryoprotektiva) die Zellen schädigen. Die Toxizität eines Kryoprotektivums steigt mit seiner Konzentration und Expositionszeit (Vajta et al. 2007).

Während des Einfrierens können 2 grundlegende Probleme auftreten:

Insbesondere langsam eingefrorene Zellen sind durch Einfrierschäden potenziell beeinträchtigt (Mazur et al. 1992).

Der wichtigste limitierende Faktor des langsamen Einfrierens ist die Geschwindigkeit des Durchtritts von Wasser und Kryoprotektiva durch die Zellmembran. Diese hängt ab von

Nach Publikation der ersten Geburt mit einem langsamen Einfrierprotokoll unter Verwendung von Propandiol/Sucrose und nachfolgender ICSI einer Oozyte beim Menschen (Porcu et al. 1997) gab es zahlreiche Berichte über die klinischen Ergebnisse bei Verwendung des langsamen Einfrierverfahrens. Das Interesse an der Kryokonservierung unfertilisierter Oozyten stieg noch einmal deutlich mit der zunehmenden Thematisierung der unterschiedlichen Optionen zur Fertilitätsprotektion vor relevanten Operationen, Chemotherapien und/oder einer Radiatio im kleinen Becken (Jeruss und Woodruff 2009).

Bereits 1996 veröffentlichten Tucker et al. ihre Daten und zeigten dabei eine Überlebensrate von lediglich 25 %, wobei aber die Fertilisierungsrate nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) mit 65 % der aus anderen Studien entsprach (Gook et al. 1995). Erwähnenswert ist, dass sich alle regelrecht fertilisierten Zellen am Tag 3 zu qualitativ guten 4- bis 12-Zell-Embryonen entwickelt hatten. Größere Studien bestätigten niedrige Überlebensraten um die 25–50 % (Gook und Edgar 2007). In Kombination mit der Kryokonservierung unfertilisierter Oozyten wurden die Zellen nach dem Auftauen durch ICSI fertilisiert. In Zusammenfassung der bis dahin publizierten Ergebnisse implantierten sich allerdings nur 2,3 von 100 aufgetauten Oozyten (Gook und Edgar 2007).

In der Folgezeit wurde versucht, durch erhöhte Saccharosekonzentrationen (bis 0,3 M) die Dehydrierung zu verbessern. Dies resultierte in Überlebensraten der Oozyten nach dem Auftauen von 39 % (0,1 M), 58 % (0,2 M) bzw. 83 % (0,3 M; Fabbri et al. 2001). Durch eine Verlängerung der Expositionszeit in 0,2 M Saccharose ergab sich ebenfalls eine Steigerung der Überlebensraten von 55 % (5 min) auf 70 % (>10 min).

In gleicher Weise führte die Verwendung von 0,3 M Saccharose im Vergleich zu 0,1 M zu einer Überlebensrate von 71 vs. 24 %, einer Fertilisierungsrate von 80 vs. 53 % sowie Teilungsrate von 91 vs. 80 % (De Santis et al. 2007). Bianchi et al. (2007) beschrieben in ihrer Klinik eine vergleichbare Fertilisierungs- (76 vs. 80 %) und Teilungsrate (94 vs. 97 %) für kryokonservierte (0,2 M Saccharose) bzw. nicht kryokonservierte Oozyten.

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse mit 0,2 M Saccharose (Gook und Edgar 2007) zeigte eine Überlebensrate von 72 % und eine Teilungsrate von 93 %, sodass nach dem Auftauen von 100 Oozyten sowie ICSI 53 Embryonen vorlagen. Bei einer Implantationsrate von 9,1 %/aufgetauter Oozyte war das Ergebnis deutlich besser als mit 0,1 M Saccharose.

Die Zusammenfassung der Daten mit 0,3 M Saccharose (Gook und Edgar 2007) beschreiben zwar ein vergleichbares Ergebnis von 49 Embryonen aus 100 aufgetauten Eizellen, aber eine Implantationsrate von lediglich 5 %/Embryo und 2,4 %/aufgetauter Oozyte. Etwa 1/3 der implantierten Zellen endeten aber in einem Abort.

Die erfolgreiche Kryokonservierung überzähliger Embryonen nach IVF sowie die aus deren Transfer resultierende Schwangerschaft wurde erstmals bei Trounson und Mohr (1983), die erste Geburt jedoch bei Zeilmaker et al. (1984) publiziert.

Man schätzt, dass heute ungefähr 20 % der nach Maßnahmen der assistierten Reproduktion geborenen Kinder aus dem Transfer kryokonservierter – meist Embryonen im Teilungsstadium und im Stadium der Blastozysten – jedoch seltener von Oozyten stammen (Ata et al. 2010).

Die Rate an Frühgeburten, Fehlbildungen und chromosomalen Anomalien nach dem Transfer kryokonservierter Embryonen differiert nicht signifikant zum Transfer nicht kryokonservierter Embryonen (Wennerholm et al. 2009). Das galt auch für das Wachstum und die mentale Entwicklung der Kinder.

In Deutschland müssen aufgrund des Embryonenschutzgesetzes in der Routine Zellen im Pronukleusstadium kryokonserviert werden. Durch eine liberalere Auslegung des Gesetzes werden mittlerweile teilweise auch Embryonen und Blastozysten langsam programmiert eingefroren, wobei die Ergebnisse nach Vitrifikation auch hier wiederum deutliche Vorteile zeigen (Youssry et al. 2008).

Obwohl bereits 1985 die erfolgreiche Vitrifikation von Mausembryonen publiziert wurde, fand diese Technik zuerst eine nur geringe Verbreitung in der Reproduktionsmedizin. Die Vitrifikation als Kryokonservierungsmethode von biologischem Material stellt jedoch eine der aufregendsten Entwicklungen der vergangenen Jahre in der Reproduktionsmedizin dar.

Bei sorgfältiger Anwendung der Vitrifikation kann die Eiskristallbildung während des Einfrierens durch Bildung einer amorphen Glasphase gänzlich verhindert werden. Hierbei gelingt es auch, jegliche Abläufe auf molekularer Ebene zu arretieren („state of suspended animation“).

Durch sehr schnelles Abkühlen des Wassers konvertiert die Lösung in einen glasähnlichen amorphen Aggregatzustand ohne jegliche kristalline Strukturen. Um in- und außerhalb der Zelle eine glasähnliche Solidifikation zu erreichen und toxische sowie osmotische Verletzungen zu minimieren, müssen die folgenden Punkte beachtet werden:

Die Bedeutung der Verwendung eines kleinen Volumens, auch als „minimal volume approach“ bezeichnet, wurde 2005 erstmals beschrieben und publiziert (Kuwayama et al. 2005; Kuwayama 2007). Als Grundregeln für die Vitrifikation gelten die in der Übersicht genannten Punkte (Seki und Mazur 2009; Mazur und Seki 2011).

Neben dem bereits oben Erwähnten existiert eine weitere Vielzahl an Variablen, welche nachhaltig den Erfolg und die Überlebensrate des biologischen Materials beeinflussen können. Aufgrund der nachfolgend aufgelisteten Gründe ist ein Standardvitrifikationsprotokoll sowohl für Eizellen als auch Embryonen ungeeignet, weil

Eiskristalle sind letal für jedes biologische Material. Die Bildung von Eiskristallen wird durch den Einsatz von Kryokonservierungsmitteln („cryoprotectant agents“) unterbunden. Die Inkubation der Zelle in einem Kryokonservierungsmittel bewirkt die Entfernung von intrazellulärem Wasser aus dem Zytoplasma via Osmose (passiv) oder Wasserkanälen (Aquaporine; aktiv). Man unterscheidet zwischen nicht permeablen Kryokonservierungsmitteln (nicht membrangängig) mit einem großen Molekulargewicht um die 300–400 (Saccharide, Proteine, Polymere) oder permeablen Kryokonservierungsmitteln (membrangängig) mit einem Molekulargewicht von <100 wie Glyzerol, Ethylenglykol (EG), Dimethylsulphoxid (DMSO).

Die membrangängigen Gefrierschutzmittel binden das intrazelluläre Wasser und verhindern damit die Formation von Eiskristallen. An dieser Stelle muss betont werden, dass Kryokonservierungmittel bei nicht sachgerechter Anwendung toxische Nebenwirkungen auf die Zelle ausüben können. Daraus resultieren beispielsweise osmotische Schäden oder Schäden an intrazellulären Kompartimenten. Erwähnenswert ist, dass in kürzlich erschienenen Publikationen (Takahashi et al. 2005; Liebermann und Tucker 2006; Liebermann 2009, 2011) bei Verwendung relativ hoher Konzentrationen an DMSO keine negativen Effekte auf die Lebendgeburtenrate beobachtet werden konnten.

Zusammenfassend lässt sich Folgendes feststellen (Tucker 2003; Liebermann und Tucker 2004):

Im Folgenden werden kurz die praktische Durchführung der Vitrifikation und der Erwärmung von Zellen besprochen.

Die erfolgreiche Kryokonservierung von menschlichen Eizellen stellt einen bedeutsamen Schritt in der Reproduktionsmedizin dar, insbesondere, wenn man bedenkt, dass es über mehr als 2 Jahrzehnte nicht gelang, das Einfrieren von Eizellen als klinische Anwendung zu etablieren. Erst mit Hilfe der Vitrifikation als Alternative zu den traditionell langsamen Einfrierprotokollen wurde es möglich, menschliche Metaphase-II-Eizellen mit gleichbleibendem Erfolg einzufrieren.

Die erste Lebendgeburt unter Verwendung von Vitrifikationsprotokollen gelang Kuleshova et al. (1999). Obwohl die Kryokonservierung von Eizellen historisch betrachtet eine geringe Effizienz aufwies (niedrige Überlebens-, Befruchtungs- und Teilungsrate), liegen heute Information von über 2000 Kindern vor.

Trotz alledem stellt sich die Frage, was die Eizellen neben ihrer Zellgröße und reduzierten Membrandurchgängigkeit von Teilungsstadien unterscheidet?

Daher sind Eizellen sowohl in Bezug auf die Aufnahme des Gefrierschutzmittels als auch die Abgabe von Wasser weniger effizient. Weitere Unterschiede sind:

Das Einfrieren von Eizellen kann die Fertilität von Frauen sichern, die

Obwohl im Vergleich zu geborenen Kindern aus langsam eingefrorenen Eizellen die Geburt des ersten Babys von vitrifizierten Eizellen viel später gelang (ca. 13 Jahre später), hat die Zahl geborener Kinder längst diejenige nach langsamer Kryokonservierung übertroffen. Alle diese Neugeborenen zeigten kein erhöhtes Risiko kongenitaler Anomalien (Noyes et al. 2009). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Vitrifikation von Eizellen nicht das Risiko für ein abnormales Imprinting oder Veränderungen in der Spindelformation oder Anordnung der Chromosomen an der Spindelplatte erhöht (Trapphoff et al. 2010).

Dies ist umso erwähnenswerter, als bekannt ist, dass die Kryokonservierung von reifen Metaphase-II-Eizellen den meiotischen Spindelapparat separiert und dadurch ein erhöhtes Aneuploidierisiko der resultierenden Embryonen bestehen könnte. Wissenschaftliche Studien haben gezeigt, dass eingefrorene Eizellen keine Chromosomenanomalien aufweisen (Gook und Edgar 1999). Eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Embryonen aus frischen und eingefrorenen Eizellen fand keinen Unterschied im Grad der Aberrationen (Cobo et al. 2001). Es ist eine bekannt, dass die meiotische Spindel sich nach dem Erwärmen wieder adäquat und unabhängig von der Kryokonservierungstechnik reformiert (Chen et al. 2004; Bianchi et al. 2005; Larman et al. 2007).

Die wissenschaftliche Literatur über die Eizellkryokonservierung wächst täglich. Die meisten Publikationen fokussieren auf die Verbesserung klinischer Schwangerschaften (Boldt et al. 2003, 2006), wobei die hierbei erzielten und publizierten Daten das Vertrauen in diese Technik untermauern.

Das Einfrieren von Vorkernstadien (Zygoten) unter Verwendung von traditionell langsamen Einfrierprotokollen ist seit Jahren, besonders in Ländern wie Deutschland, das die Kryokonservierung von menschlichen Embryonen nach Kernverschmelzung per Gesetz untersagt, etabliert.

Etwa 98 min werden benötigt, um Zygoten per traditionellem Protokoll einzufrieren. Die klinischen Schwangerschaftsraten belaufen sich auf 18 % mit einer Implantationsrate (IR) von 10 % per transferiertem Embryo. Im Gegensatz dazu benötigt die Vitrifikation von Zygoten ca. 12 min.

Die Überlebensrate vitrifizierte Zygoten liegt bei >90 % mit einer Teilungsrate von 80 % am Tag 2, einer Blastozystenformationsrate am Tag 5 > 30 % (Park et al. 2000; Jelinkova et al. 2002; Liebermann et al. 2002b; Al-Hasani et al. 2007). Al-Hasani et al. (2007) publizierten klinische Schwangerschafts- und Implantationsraten von 30 % und 17 %. Das Vorkernstadium durchläuft nach der Befruchtung signifikante Veränderungen der Membranpermeabilität, die wiederum verantwortlich dafür sind, dass das Oolemma der Zygote mehr Stabilität aufweist. Des Weiteren können Vorkernzellen einen Kälteschock und osmotische Veränderungen während der Vitrifikation und Erwärmung besser tolerieren.

Über die Vitrifikation von Embryonen liegen zahlreiche Publikationen vor. Abhängig von der Wahl des Trägersystems demonstrierten Liebermann und Tucker (2002) Überlebensraten von 80–90 %. Gute Teilungsraten und eine Morulabildung in >30 % wurden beobachtet. Weitere Publikationen bestätigten diese Ergebnisse (Mukaida et al. 1998). Die Überlebensrate von Embryonen nach langsamem Einfrieren oder Vitrifikation liegen vergleichbar um die 75–80 % (Jericho et al. 2003). Erfolgreiche Schwangerschaften und Lebendgeburten von vitrifizierten Teilungsstadien wurden beschrieben (El-Danasouri und Selman 2001; Selman und El-Danasouri 2002; Rama Raju et al. 2005; Desai et al. 2007). Trotz der Tatsache, dass gute Überlebensraten erreicht wurden (Liebermann und Tucker 2002), entwickelten sich nur ca. 35 % der erwärmten Teilungsstadien zum Morulastadium.

Loutradi et al. (2008) publizierten eine Metaanalyse und einen systematischen Review zur Kryokonservierung von Teilungsstadien unter Verwendung von traditionellen langsamen vs. Vitrifikationsprotokollen und fanden eine Überlebensrate von 84 % vs. 97 %. Vitrifikationsprotokolle zeigten sich aber auch im Vergleich mit traditionell langsamen Protokollen hinsichtlich klinischer Schwangerschafts- (48 % vs. 35 %) und Implantationsraten (39 % vs. 15 %) deutlich überlegen (Rama Raju et al. 2005; Desai et al. 2007; Li et al. 2007; Balaban et al. 2008).

Rama Raju et al. (2009) verglichen Neugeborene aus vitrifizierten Teilungsstadien mit Neugeborenen aus frisch transferierten Teilungsstadien und fanden keine signifikante Erhöhung kongenitaler Anomalien.

Zahlreiche Schwangerschaften und Lebendgeburten von vitrifizierten menschlichen Blastozysten mit unterschiedlichen Trägersystemen wurden publiziert (Mukaida et al. 2003a, b; Son et al. 2003; Liebermann 2015). Die Blastozyste ist ebenso wie die unbefruchtete Eizelle besonders empfindlich gegenüber niedrigen Temperaturen. Ihre Besonderheit liegt im flüssigkeitsgefüllten Blastozoel. Es ist bekannt, dass die Überlebensrate nach Vitrifikation mit zunehmendem Volumen des Blastozoels abnimmt (Mukaida et al. 2006). Eine mögliche Ursache dafür könnte eine nicht ausreichende Permeation des Kryokonservierungsmittels sein, sodass intrazellulär Restwasser verbleibt, das dann kristallisiert. Hilfreich ist die artifizielle Reduktion des Blastozoels vor der Vitrifikation (Vanderzwalmen et al. 2002; Hiraoka et al. 2004; Liebermann und Conaghan 2013). Sowohl lwayama et al. (2011) als auch Hur et al. (2011) erzielten höhere Implantationsraten und klinische Schwangerschaftsraten, nachdem die Größe des Blastozoels vor der Vitrifikation reduziert wurde. Alle hier zitierten Literaturstellen kommen zu dem Schluss, dass ein Kollapieren des Blastozoels vor der Vitrifikation die Schwangerschaftsraten von transferrierten vitrifizierten und erwärmten Blastozysten erhöht und somit auch die kumulative Schwangerschafts- und Implanationsrate.

Nach Vitrifikation menschlicher Blastozysten unter Anwendung von Cryoloops betrug die Überlebensrate 72–90 %, die klinische Schwangerschaftsrate 37–53 % und die Implantationsrate 22–30 % (Mukaida et al. 2001, 2003a, b; Vanderzwalmen et al. 2002, 2003; Liebermann und Tucker 2006; Liebermann 2009, 2011, 2015).

Die Aktivierung des embryonalen Genoms erfolgt im 8-Zell-Stadium ungefähr 3 Tage nach Eizellentnahme (Braude et al. 1988). Ohne diese Aktivierung würde der Embryo sich nicht weiterentwickeln und somit nicht überleben.

Weitere Vorteile des Transfers sowie der Kryokonservierung menschlicher Embryonen im Blastzystenstadium sind:

Über einen Zeitraum von 2004 bis 2016 wurden in den Fertility Centers of Illinois „IVF Labor River North“ (Chicago) 33.476 Blastozysten von 8289 Patienten mit einem Durchschnittsalter von 34,6 ± 6,0 Jahren vitrifiziert. Die Mehrheit der Blastozysten wurde am Tag 5 vitrifiziert (55 %), 43,5 % am Tag 6 und eine Minderheit von 1,5 % am Tag 7 (Tab. 1).

Nach 13 Jahren der Vitrifikation von Blastozysten unter der Anwendung eines offenen Systems (Cryotop) und eines geschlossenen Systems (HSV; High Security Vitrification System) wurde in 6706 Transfers mit einem Durchschnitt von 1,7 Blastozysten pro Transfer folgendes pränatales Ergebnis erreicht: Aus 1914 Entbindungen wurden 2336 Kinder (1203 Mädchen und 1133 Jungen) geboren (Tab. 2). Es wurden keine nennenswerten Abnormalitäten registriert.

In Tab. 3 werden Daten zusammengefasst, welche an Schwangerschaftsdauer und Geburtsgewicht von 1363 geborenen Kindern erhoben wurden. 926 Kinder waren von vitrifizierten und erwärmten Tag-5- und Tag-6-Blastozysten-Transfers (VBT), während 437 Kinder nach einem frischen Transfer von einem Embryo (selektiver Transfer von einer Tag-5-Blastozyste, SFBT) geboren wurden. Wenn Kinder von vitrifizierten und erwärmten Tag-5- (n = 561) und Tag-6-Blastozysten (n = 365) in Bezug auf Schwangerschaftsdauer und Geburtsgewicht mit Hilfe eines T-Tests verglichen wurden, wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede (p = 0,71 und p = 0,124) festgestellt. Bekanntlich korreliert die Schwangerschaftsdauer mit dem Geburtsgewicht, jedoch wurden keine Unterschiede zwischen SFBT und VBT beobachtet. Tab. 3 zeigt jedoch auch, dass mit Hilfe des One-way ANOVA-Tests ein signifikanter Unterschied (p = 0,013) im Geburtsgewicht zwischen SFBT und VBT gefunden wurde. Tendenziell zeigte die VBT-Gruppe ein höheres Geburtsgwicht. Diese Daten bestätigen früher publizierte Beobachtungen von Pinborg et al. (2014). Tab. 3 zeigt auch, dass Chi-Square keinen signifikanten Unterschied in der prozentualen Verteilung von Mädchen und Jungen geboren nach vitrifizierten, erwärmten oder frisch transferrierten Embryonen (χ²; p = 0,2454) finden konnte. Wurden die beiden Geschlechter von frischen und vitrifizierten und erwärmten Transfers kombiniert, konnte mit Hilfe eines T-Tests ein signifikanter, aber auch ein zu erwartender Unterschied im Geburtsgewicht zwischen Jungen und Mädchen gemessen werden (p <0,001) (Tab. 4). Jungen waren im Durchschnitt 157,2 g schwerer als Mädchen. Zusammenfassend wurde beoachtet, dass 110 Kinder ein Geburtsgewicht von weniger als 2500 g hatten (definiert als niedriges Geburtsgewicht) und 159 Kinder ein Geburtsgewicht zwischen 4000 und 4500 g (definiert als hohes Geburtsgwicht), während 33 Kinder ein Gewicht von mehr als 4500 g (definiert als Makrosomia) aufwiesen (Tab. 4).

Tab. 5 und 6 zeigen klinische Daten von vitrifizierten und erwärmten Blastozysten entsprechend ihrem Entwicklungsstadium (Tag 5 und Tag 6) und von Patienten mit Donor-Rezipient-Zyklen. Bei Patientinnen jünger als 35 Jahre ergaben sich folgende Daten (Transfer von Tag-5-Blastozysten, n = 1977 vs. Transfer von Tag-6-Blastozysten, n = 1032): Überlebens-, Implantations- und klinische Schwangerschaftsrate: 98,4 % vs. 97,7 %, 45,1 % vs. 32,4 % und 56,0 % vs. 44,0 %.

In 2007 erfolgte ein Wechsel des Trägersystems von einem „offenen“ zu einem geschlossenen, aseptischen System (High Security Vitrification Kit). Seitdem wurden folgende Überlebens-, Implantations- und klinische Schwangerschaftsraten erzielt: 99,0 %, 39,3 % und 50,1 % (Tab. 7).

Tab. 8 zeigt klinische Daten von vitrifizierten und erwärmten Blastozysten entsprechend ihrem Entwicklungsstadium (Tag 5, n = 3552; Tag 6, n = 1979; Tag 7, n = 44). Folgende Daten (Transfer von Tag-5-Blastozysten vs. Transfer von Tag-6-Blastozysten vs. Transfer von Tag-7-Blastozysten): Überlebens-, Implantations- und klinische Schwangerschaftsrate: 99,2 % vs. 98,76 % vs, 97,3 %, 44,0 % vs. 31,9 % vs. 12,5 % und 54,8 % vs. 42,5 % vs. 18,2 %.

Zwischen 2007 und 2016 führte das Fertility Centers of Illinois (Chicago) 2765 Transfers mit vitrifizierten und erwärmten Blastozysten durch, ohne das Blastcoel vor der Vitrifikaton zu kollapieren (Gruppe A), wohingegen in 2765 Transfers das Blastocoel vor der Vitrifikation kollapiert wurde (Gruppe B). Wurden die vitrifizierten und erwärmten Transfers eingeteilt in Tag-5- und Tag-6-Blastozysten, wurden folgende Daten erfasst (Tab. 9): in 1622 Tag-5-Blastozysen-Transfers von Gruppe A (Durchschnittsalter 35,5 ± 5,0) verglichen mit 1930 Tag-5-Blastozysten-Transfers von Gruppe B (Durchschnittsalter 35,2 ± 4,8), die Implantations-, klinische und angehende Schwangerschaftsrate war wie folgt: 38,5 %, 48,9 % und 40 % vs. 49 %, 59,7 % und 51,5 %. Wie Tab. 9 zeigt, waren die Schwangerschaftsraten von vitrifizierten und erwärmten Tag-5-Blastozysten in Gruppe B signifikant besser als mit vitrifizierten und erwärmten Tag-5-Blastozysten in Gruppe A.

Wurden die Daten von vitrifizierten und erwärmten Tag-6-Blastozysten verglichen, wurden folgende Daten zwischen Gruppe A (n = 1143; Durchschnittsalter 36,1 ± 4,8) und Gruppe B (n = 835; Durchschnittsalter 36,4 ± 4,7) in Bezug auf Implantations-, klinische und angehende Schwangerschaftsrate ermittelt: 26,6 %, 36,4 %, 27,3 % vs. 39,7 %, 50,7 % und 41,6 %. Wie Tab. 9 zeigt, waren die Outcome-Daten von vitrifizierten und erwärmten Tag-6-Blastozysten in Gruppe B signifikant besser im Vergleich zu vitrifizierten und erwärmten Tag-6-Blastozysten in Gruppe A.