Labortechniken: PID, PKD, PGT, Time-lapse Imaging

Ein etabliertes Portfolio an Standardtechniken ist essenziell, um ein IVF-Programm zu etablieren und kontinuierlich erfolgreich zu betreiben. Andererseits werden gerade in diesem Bereich immer wieder zusätzliche Labortechniken vorgestellt, die das Ziel haben, einen implantationskompetenten Embryo zu identifizieren, die Erfolgsrate zu verbessern und die Mehrlingsrate zu senken. Unter diesen Techniken wird die Untersuchung des numerischen chromosomalen Status (Aneuploidiediagnostik) der Eizelle bzw. des Embryos im Rahmen der In-vitro-Fertilisations-Behandlung (IVF) seit langem und zum Teil sehr kontrovers diskutiert. Dieser Beitrag soll den aktuellen Stand der Präimplantationsdiagnostik (PID) für Aneuploidien zusammenfassen und einen Ausblick auf mögliche weitere Entwicklungen geben.

Eine klinische Signifikanz ergibt sich angesichts der hohen Zahl von Neugeborenen mit Aneuploidiesyndromen, wie z. B. Trisomie 21, und von Aborten, bei denen etwa 70 % ursächlich auf Aneuploidien zurückzuführen sind (Menasha et al. 2005).

Das Risiko für Aneuploidien in Eizellen und Embryonen ist in der frühen reproduktiven Phase eher gering, erhöht sich jedoch ab dem 30. Lebensjahr signifikant mit einem exponentiellen Anstieg der Aneuploidieraten jenseits des 37. Lebensjahrs. Eine Analyse von Eizellen in einer Gruppe von Patientinnen im Alter zwischen 18 und 30 Jahren – bei einem Durchschnittsalter von 29 Jahren – mittels Polkörperbiopsie und Array-komparative genomische Hybridisierung (aCGH) ergab eine Aneuploidierate von 22,6 % (Fragouli et al. 2006), wogegen die Aneuploidierate in Eizellen von Patientinnen über 40 Jahren über 75 % liegt (Geraedts et al. 2011). Erhöhte Aneuploidieraten in Embryonen von Frauen über 37 Jahren, Paaren mit wiederholtem Implantationsversagen nach IVF-Therapie und wiederholten Fehlgeburten sind vielfach belegt. Munné et al. (2005) dokumentierten eine Aneuploidierate von 58 % bei Patientinnen unter 30 Jahren verglichen mit 77 % bei Patientinnen über 39 Jahren. 20 % der jungen Patientinnen hatten weniger als 25 % chromosomal unauffällige Embryonen; jedoch nur 5 % der Patientinnen über 40 Jahren wiesen mehr als 50 % normale Embryonen auf (Munné et al. 2005).

Die hohe Inzidenz aneuploider Embryonen führte zu der Hypothese, dass, wenn im Rahmen einer IVF-Behandlung ausschließlich euploide Embryonen transferiert werden würden, die Chance auf die Geburt eines gesunden Kindes steigen müsste. Demzufolge wurde der Einsatz des genetischen Präimplantationsscreenings (Pre-Implantation Genetic Testing for Aneuploidies; PGT-A) zur Verbesserung der IVF-Erfolgsraten älterer Patientinnen sehr propagiert. PGT-A wurde dabei mehrheitlich mittels der Untersuchung von Embryonen durchgeführt, denen in der Regel im 8-Zellstadium in den Anfängen zwei, später eine Blastomere entnommen wurden. Die Diagnose des chromosomalen Status erfolgte mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs-Technik (FISH), wobei meist nur 6 bis maximal 10 Chromosomen untersucht werden konnten. Im Zeitraum von 2007 bis 2010 wurden mindestens 10 randomisierte kontrollierte Studien nach Blastomerenbiopsie mit anschließender FISH-Diagnostik publiziert, von denen keine eine Erhöhung der Geburtenraten nach PGT-A belegen konnte (Übersicht bei Geraedts et al. 2010). Als mögliche Erklärung wurde angeführt, dass nicht alle Chromosomen getestet werden konnten und dass die biopsierten Blastomeren aufgrund von Mosaikbildungen nicht immer wirklich repräsentativ für den Embryo im 8-Zellstadium sind. Zusätzlich kann die Blastomerenbiopsie selbst das Entwicklungspotenzial des biopsierten Embryos beeinträchtigen, insbesondere bei der Entnahme von 2 Blastomeren bzw. bei unzureichendem Training des durchführenden embryologischen Labors.

Die Fortführung der Blastomerenbiopsie zur Aneuploidiediagnostik wurde von führenden internationalen Fachgesellschaften nicht empfohlen, und es wurden grundlegende Studien zum Nutzen der Methode vor dem weiteren therapeutischen Einsatz gefordert. Als Folge der kontrovers diskutierten Ergebnisse des Aneuploidie-Screenings wurden alternative Vorgehensweisen im Rahmen der IVF-Behandlung diskutiert: die Diagnose auf Basis des 1. und 2. Polkörpers oder anhand von Zellen des Trophektoderms im Blastozystenstadium.

Die European Society for Human Reproduction & Embryology (ESHRE) hatte aufgrund dieser Überlegungen eine randomisierte kontrollierte Studie auf der Basis der Polkörperdiagnostik (PKD) in Verbindung mit der Analyse aller Chromosomen durch aCGH initiiert (Geraedts et al. 2010). Die Daten der zugehörigen Pilotstudie wurden im Jahr 2011 veröffentlicht (Geraedts et al. 2010, 2011; Magli et al. 2011). In vielen anderen Ländern und insbesondere in den USA wurde hingegen die Entnahme von Trophektodermzellen im Blastozystenstadium favorisiert. Diese wurden ursprünglich in Verbindung mit aCGH untersucht, inzwischen jedoch zunehmend mit dem NGS-Verfahren (Next-Generation Sequencing). Die Durchführung der verschiedenen Vorgehensweisen in Bezug auf PGT-A und die Vor- und Nachteile der jeweiligen Methode sind in Tab. 1 dargestellt und sollen im Folgenden genauer ausgeführt werden.

Die Polkörper entstehen im Rahmen der meiotischen Reifeteilung. Der erste Polkörper ist charakteristisch für die reife Metaphase-II-Eizelle und enthält einen kompletten Chromosomensatz, der aus gepaarten Chromatiden besteht. Durch das Eindringen des Spermiums wird die Eizelle aktiviert und die meiotische Teilung wird abgeschlossen, indem der 2. Polkörper ca. 2–4 h nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) ausgeschleust wird. Der 2. Polkörper enthält einen kompletten Chromatidensatz; ein Chromatidensatz verbleibt in der Eizelle und bildet den weiblichen Vorkern, der später mit dem aus dem Chromatidensatz des Spermiums entstandenen männlichen Vorkern verschmilzt.

Aneuploidien in der Eizelle entstehen durch eine vorzeitige Chromatidentrennung im Rahmen der Meiose (Handyside et al. 2012). Eine Eizelle ist dann euploid, wenn bei der PKD im 1. Polkörper für jedes Chromosom 2 Chromatiden nachweisbar sind und im 2. Polkörper 1 Chromatid. Ist für beide Polkörper die Zahl der detektierten Chromatiden weniger als 3, so wird der entstehende Embryo für das betreffende Chromosom eine Trisomie aufweisen, ist die Zahl der detektierten Chromatiden mehr als 3, eine Monosomie. Ein Sonderfall liegt dann vor, wenn für ein bestimmtes Chromosom im 1. Polkörper 1 Chromatid vorliegt und im 2. Polkörper 2 Chromatiden. Die Eizelle verfügt dann über die korrekte Anzahl an Chromatiden und ist euploid. Lange Zeit wurde dieser Befund jedoch kritisch bewertet, da bei Embryonen aus solchen Eizellen eine höhere Mosaikrate beobachtet wurde. Inzwischen sind jedoch mehrere Veröffentlichungen erschienen, die bei dem geschilderten Befund von der Geburt gesunder Kinder berichten (Scott et al. 2012; Forman et al. 2013).

Die Polkörperbiopsie wird bei sachgemäßer Durchführung als eine Methode angesehen, bei der die weitere Entwicklung des entstehenden Embryos nicht beeinträchtigt wird (Schenk et al. 2018). Zudem haben beide Polkörper keine Bedeutung für die weitere Entwicklung der Eizelle. Ein großer Nachteil der PKD liegt darin, dass beide Polkörper nur mütterliche chromosomale Anteile enthalten, das heißt eine Diagnose möglicher väterlicher Aneuploidien, welche durch das Spermium hervorgerufen werden und sich erst im entstehenden Embryo manifestieren, ist mit der PKD nicht möglich. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass eine Entnahme der Polkörper bereits sehr früh erfolgt und in der Regel auch die Diagnose mittels aCGH/NGS umgehend durchgeführt wird. Zu diesem Zeitpunkt ist jedoch nicht absehbar, welche Eizellen entwicklungsfähig sind und sich zu einem transferfähigen Embryo entwickeln. Da zudem pro Eizelle zwei diagnostische Untersuchungen durchgeführt werden müssen – jeweils eine für jeden Polkörper –, verdoppeln sich auch die Kosten für die Diagnostik und liegen um ein Vielfaches über denen einer Diagnose an Trophektodermzellen im Blastozystenstadium.

Ein Vorteil der PKD ist hingegen die Tatsache, dass das Problem der Mosaikbildung, welches bei Embryonen in frühen Teilungsstadien eine wesentliche Limitation des Aneuploidie-Screenings darstellt, bei der PKD durch die direkte Untersuchung der Eizellen bzw. der zugehörigen Polkörper auf Aneuploidien umgangen werden kann.

Die Biopsie des 1. und 2. Polkörpers kann sequenziell oder simultan erfolgen (Abb. 1). Bei der sequenziellen Entnahme wird zunächst der 1. Polkörper vor oder unmittelbar nach der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion entnommen. Hierzu wird die Eizellhülle, die Zona pellucida, entweder mit Hilfe eines Lasers oder mechanisch eröffnet, um für die benötigte Biopsiekapillare einen Zugang in den perivitellinen Spalt zu schaffen. Alternativ kann eine simultane Entnahme beider Polkörper 9–12 h nach der ICSI durchgeführt werden. Es liegen Daten vor, dass in Verbindung mit aCGH die Entnahme des 2. Polkörpers zwischen 49 und 53 h nach hCG-Injektion erfolgen sollte, da eine zu frühe Entnahme des 2. Polkörpers die Amplifikation der DNA im Rahmen der aCGH beeinträchtigen kann (Magli et al. 2011). Die Polkörper werden in die Biopsiekapillare aspiriert und anschließend in separate Mediumtropfen abgelegt. Anschließend werden der 1. und der 2. Polkörper für die weitere Chromosomenanalyse in unterschiedliche Reaktionsgefäße überführt.

Die aCGH-Analyse des 1. und 2. Polkörpers ist innerhalb eines Zeitraums von 12 h durchführbar und ermöglicht eine akzeptable Vorhersagegenauigkeit bezüglich des Chromosomenstatus in über 90 % der zugehörigen Eizellen, was somit den frischen Transfer des/r entstandenen Embryo/nen ohne zwischenzeitliche Kryokonservierung ermöglicht (Magli et al. 2011). Dies ist in Deutschland und auch in der Schweiz von Bedeutung, da die Entnahme von Blastomeren in späteren embryonalen Entwicklungsstadien für ein ausschließliches Aneuploidie-Screening derzeit aus gesetzlichen Gründen nicht möglich ist.

Die Auswertung der multizentrischen randomisierten klinischen Studie der ESHRE zum PGT-A nach PKD zeigt allerdings, dass PGT-A am 1. und 2. Polkörper in Verbindung mit aCGH zum Transfer euploider Embryonen die Lebendgeburtenrate bei Frauen im Alter von 36 bis 40 Jahren nicht wesentlich erhöht (Verpoest et al. 2018). Eine nachträgliche Analyse dieser Studie nach ökonomischen Gesichtspunkten belegt, dass PGT-A mittels PKD und aCGH eine sehr hohe finanzielle Belastung für die behandelten Paare bedeuten kann (Neumann et al. 2020).

Vor diesem Hintergrund und unter Berücksichtigung der geringeren Vorhersage-Genauigkeit der PKD im Vergleich zur Diagnose an Trophektodermzellen (Capalbo et al. 2013; Christopikou et al. 2013; Salvaggio et al. 2014) wird die PKD zunehmend weniger angeboten.

Der Nachteil der Aneuploidiediagnostik an frühen embryonalen Teilungsstadien (Tag-3-Embryonen) wurde bereits diskutiert. Die Methode wird dennoch nach wie vor in vielen Zentren eingesetzt. Es ist derzeit unklar, inwieweit ein möglicher Vorteil der Aneuploidiediagnostik an Embryonen den dokumentierten Nachteil einer Blastomerenentnahme im 8-Zellstadium überwiegt. Das Problem der Mosaikbildung kann auch durch die Untersuchung aller Chromosomen mittels der aCGH nicht ausgeschlossen werden.

Es ist nicht geklärt, ob dieses Ergebnis durch die Mosaikbildung bei frühen Embryonen zustande kommt oder ob zumindest bei einigen Embryonen mögliche Korrekturmechanismen stattfinden können.

Die Entnahme von Zellen des Trophektoderms im Blastozystenstadium wurde bereits 1997 vorgestellt. Es bedurfte jedoch erst einer weiteren Verbreitung der Tag-5-Kultur und der kontroversen Diskussion zum PGT-A, bevor die Biopsie am Tag 5 vermehrt als Alternative zur Blastomerenbiopsie eingesetzt wurde. Ein wesentlicher Faktor, der den Einsatz der Methode ebenfalls unterstützt hat, war die Einführung der Vitrifikation. Die hohen Überlebensraten nach Vitrifikation von Blastozysten und die gleichen bzw. in manchen Fällen besseren Implantationsergebnisse durch ein optimal vorbereitetes Endometrium ermöglichen eine chromosomale Diagnostik ohne Zeitdruck. In der Regel werden vom Trophektoderm mehrere Zellen entnommen, sodass die anschließende Amplifikation der DNA problemlos ist, da es sich im Unterschied zur Blastomerenbiopsie oder PKD nicht um eine Einzelzelldiagnostik handelt.

Es liegen inzwischen mehrere randomisierte kontrollierte Studien zum Einsatz von PGT-A mit aCGH oder NGS nach Blastozystenbiopsie vor. Diese Studien belegen eine Zunahme der Schwangerschaftsrate bezogen auf den erfolgten Transfer. Es muss jedoch klar darauf hingewiesen werden, dass bei einem nicht unerheblichen Teil der Patienten kein Transfer stattfindet. Dies ist dadurch begründet, dass nicht in jedem Zyklus die Embryonen auch das Blastozystenstadium erreichen. Wenn Blastozysten zur Biopsie vorhanden sind, die sämtlich aneuploid sind, wird kein Transfer möglich sein. Insofern sind die Erfolgsraten bei Patientinnen, die einen Zyklus mit der Intention eines Aneuploidie-Screenings durch Blastozystenbiopsie starten, bezogen auf den gestarteten Zyklus relativ gering (Kushnir et al. 2016). Sehr kontroverse Ergebnisse wurden in einer großen multizentrischen Studie, STAR-trial (Single Embryo TrAnsfeR of Euploid Embryos; Munné et al. 2019; Munné et al. 2017a) erzielt. Demnach konnte mit PGT-A nach Blastozystenbiopsie und NGS in den untersuchten Altersgruppen von 25 bis 40 Jahren weder eine signifikant höhere Schwangerschaftsrate noch eine reduziere Fehlgeburtenrate erzielt werden.

Auch nach Blastozystenbiopsie und NGS werden Mosaike diagnostiziert, also Zellen des Trophektoderms, die unterschiedliche Chromosomenkonstitutionen (aneuploid und euploid) aufweisen. Im Unterschied zur aCGH ermöglicht NGS eine bessere Quantifizierung des Mosaik-Grades. Dies fließt in die Entscheidung mit ein, ob ein Embryo transferiert werden kann oder nicht.

Nach Transfer von Embryonen mit unterschiedlichem Anteil von euploiden und aneuploiden Zellen im Trophektoderm wurden gesunde Kinder geboren (Greco et al. 2015). Inzwischen liegen Daten vor, wonach sowohl die Mosaikrate als auch die Aneuploidierate zwischen verschiedenen Zentren stark schwanken können. Dies könnte ein Hinweis auf den Einfluss der Stimulation (Munné et al. 2017b) und/oder des Labors auf die mitotischen Zellteilungen der Embryonalentwicklung (Swain 2019) sein. Wenn Mosaike im Trophektoderm nachweisbar sind, stellt sich unweigerlich die generelle Frage, wie aussagekräftig bzw. zuverlässig eine Diagnostik an Trophektodermzellen für die chromosomale Konstitution der inneren Zellmasse ist, da aus Letzterer sich schließlich der Fetus entwickelt.

Mittlerweile wurde eine sogenannte „Non-selection“ Trophektodermbiopsie Studie veröffentlicht, bei der nach der Biopsie der morphologisch beste Embryo transferiert wurde und NGS erst nach dem Ergebnis des Schwangerschaftstests durchgeführt wurde (Tiegs et al. 2020). Die Ergebnisse zeigten eindrücklich, dass keiner der im Nachhinein als aneuploid diagnostizierten Embryonen zu einer klinischen Schwangerschaft führte. Im Vergleich zu einer Alters-korrelierten Vergleichsgruppe ohne Trophektodermbiopsie zeigte sich auch keine Biopsie-bedingte Beeinträchtigung der Schwangerschaftsrate.

Die gebräuchlichsten Nachweismethoden werden im Folgenden kurz beschrieben. Eine Übersicht über die Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden findet sich in einer Übersichtsarbeit von Handyside (2013).

Im Zusammenhang mit der Durchführung eines Aneuploidie-Screenings sind zahlreiche Labortechniken fester Bestandteil des embryologischen Repertoires bzw. ergeben sich aus der Expertise der kollaborierenden genetischen Zentren. PGT-A wird in der Regel als eine absolute Methode angesehen, mit der eine eindeutige Aussage getroffen werden kann, ob ein Embryo euploid oder aneuploid ist. Auf die Begrenzungen der PKD wurde in diesem Zusammenhang eindeutig hingewiesen. Die im Rahmen der Blastomerenbiopsie diskutierte Problematik der Mosaikbildung wird inzwischen auch bei der Blastozystenbiopsie als reelles Risiko diskutiert. Somit kann auch die als Goldstandard angesehene Blastozystenbiopsie keine absolute Diagnosesicherheit geben. Eine weitere Verbreitung und Anwendung des PGT ist vorhersehbar, auch wenn die Vorteile des PGT-A nach wie vor kontrovers diskutiert werden (Gleicher et al. 2014; Mastenbroek und Repping 2014; Munné et al. 2017b; Verpoest et al. 2018). Komplementäre Labortechniken, mit denen PGT-A für eine bessere Risikoabschätzung sinnvoll kombiniert werden kann, werden zunehmend an Bedeutung gewinnen. Insbesondere TLI kann eingesetzt werden, um die Durchführung der Biopsie zu optimieren bzw. die Zahl der zur Biopsie vorgesehenen Blastozysten zu begrenzen, wenn ein Teilungsmuster auf ein hohes Aneuploidierisiko hinweist. Eine ausschließlich auf nichtinvasiven Labortechniken beruhende Aneuploidiediagnostik ist derzeit noch nicht etabliert.