Reproduktionsmedizin
Autoren
Jürgen Liebermann

Kryokonservierung

Die Kryokonservierung ist ein wesentlicher Baustein heutiger klinischer Infertilitätsbehandlung. Hierbei findet insbesondere die Vitrifikation eine weitverbreitete routinemäßige Anwendung. Ihre Etablierung erlaubt heute eine Maximierung der Wahrscheinlickeit einer Konzeption eines jeden einzelnen IVF-Zyklus durch die Kryokonservierung von nicht transferrierten Embryonen. Dies führt zu einer maximalen Nutzung aller gewonnenen Eizellen und erzeugten Embryonen. Darüber hinaus erlaubt die Technologie der Vitrifikation die Möglichkeit, einen frischen Embryotransfer, wie in Fällen von nicht optimaler uterinärer Vorbereitung, Fertilitätskonservierung, Präimplantationsdiagnose oder Notfällen wie Problemen in der Spermagewinnung, abzusagen. In diesem Kapitel wird die Anwendung der Vitrifikation von Eizellen bis hin zur Blastozyste beschrieben. Die vorgestellten Resultate unterstreichen einmal mehr die Robustheit der Vitrifikation für die Krykonservierung von menschlichen Gameten und Embryonen.

Einleitung

Die Kryokonservierung von menschlichen Zellen hat sich seit den Publikationen über die erste erfolgreiche Kryokonservierung von Maus-Embryonen (Whittingham et al. 1972), die erste Schwangerschaft (Trounson und Mohr 1983) bzw. Geburt (Zeilmaker et al. 1984) nach Kryokonservierung eines menschlichen Embryos bzw. einer unfertilisierten Eizelle (Chen 1986) in der klinischen Routine eines jeden reproduktionsmedizinischen Labors etabliert. Der Begriff Kryokonservierung bezieht sich auf die Lagerung vitaler Zellen und Gewebe in flüssigem Stickstoff bei −196 °C. Der Beitrag der Kryokonservierung auf das Wachstum und die zunehmende Effizienz der assistierenden Reproduktionsmedizin wird heute hochgeschätzt. Des Weiteren führt die routinemäßige Kryokonservierung von Blastozysten zu einer deutlichen Zunahme der Schwangerschaftsraten. Tatsächlich ist es heute Realität, vergleichbar hohe Implanations- und Schwangerschaftsraten mit vitrifizierten, erwärmten und frischen Blastozysten zu erzielen. Durch eine zunehmende Verlässlichkeit der Kryokonservierungsprotokolle und Techniken ist es möglich geworden, die Anzahl der zu transferrierenden Embryonen zu reduzieren, welches wiederum in einer Reduktion von Mehrlingsschwangerschaften und einer Zunahme von gesunden Implantationen resultiert.
Da unter natürlichen Bedingungen menschliche Zellen/Gewebe keine Exposition gegenüber diesen niedrigen Temperaturen erleben, bedürfen sie der Anwendung kryoprotektiver Lösungen sowie definierter Einfrierverfahren, damit sie diesen Prozess sowie das spätere Auftauen ohne Vitalitätsverlust überleben. Dabei ist in den letzten Jahren ein eindeutiger Trend von der zeitintensiven langsamen Kryokonservierung, für die programmierbare Einfriergeräte erforderlich sind, zur sog. Vitrifikation, einem zeiteffektiven ultraschnellen Einfrierverfahren ohne kostenintensive Gerätetechnik, zu beobachten (Liebermann et al. 2002a).
Des Weiteren muss darauf hingewiesen werden, dass die Kryokonservierung ohne Zweifel Einfluss nimmt auf die intra- und extrazelluläre Homeostasis. Dies kann möglicherweise zu einer abnormalen Spindelmorphologie, Chromation-nondisjunctions, Fertilisationsfehlern und abnormalen mitotischen Teilungen während der embryonalen Entwicklung führen. Erwähnenswert ist auch, dass spezielle zelluläre Kompartments Transkripte und Proteine enthalten, welche verantwortlich sind für die Spindelformation, epigenetische Kontrolle und das Ausrichten der Chromosomen an der Äquatorialplatte der meiotischen Spindel. Die aktuelle Literatur konnte keine Anzeichen eines erhöhten Risikos von durch imprinting verursachten Erkrankungen in Lebendgeburten von vitrifizierten Eizellen und Embryonen finden (Trapphoff 2015).
Dieses Kapitel legt daher eine deutliche Gewichtung auf die in der Routine zunehmend im Fokus stehende Vitrifikation.

Langsame Kryokonservierung („slow freezing“)

Grundlagen

Das traditionell langsame Einfrieren („slow freezing“) beinhaltet das langsame kontrollierte Einfrieren, welches bei relativ niedrigen Konzentrationen der Kryoprotektiva den Austritt des intrazellulären Wassers aus den Zellen während der Prozedur ermöglicht.
Für Zellen ist nicht die Lagerung bei niedrigen Temperaturen, sondern die Letalität in einer intermediären Temperaturzone (−15 °C bis −60 °C) problematisch, die sie sowohl während des Einfrierens als auch des Auftauens durchlaufen müssen (Mazur 1963).
Bis zu einer Temperatur von −5 °C sind die Zellen und das umgebende Medium ungefroren und unterkühlt („supercooled“). Zwischen −5 und −10 °C bildet sich im umgebenden Medium Eis (entweder spontan oder als Folge des Seedings der Lösung). Die Einfrierverfahren zielen darauf ab, die intrazelluläre Kristallisation zu vermeiden, die die Zellen zerstören und deren Avitalität verursachen würde.
Wenn die Abkühlung langsam abläuft, verlässt das Wasser die Zelle schnell genug, um eine Konzentration der intrazellulären Lösungen zu erreichen. Die Zellen dehydrieren, und die intrazelluläre Eisbildung wird verhindert.
Erfolgt die Abkühlung aber zu langsam, schrumpfen die Zellen stark und sind den erhöhten intrazellulären Konzentrationen zu lange ausgesetzt. Beide Phänomene können eine Zellschädigung verursachen.
Das traditionell langsame Einfrieren, auch als „equilibrium freezing“ bezeichnet, beinhaltet die Äquilibrierung der Zellen in relativ niedrigen Kryoprotektiva-Konzentrationen (ca. 1,5 M) sowie die Dehydrierung während des Einfrierens bei langsamen, genau festgelegten Kühlraten (0,3–2 °C/min). Diese Methode wurde zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen erstmals erfolgreich angewendet (Whittingham et al. 1972). Erst 1977 allerdings berichtete Whittingham über die erste Geburt nach Kryokonservierung von Mäuseoozyten in flüssigem Stickstoff bei −196 °C.
Kryoprotektiva können durch direkte (permeable Kryoprotektiva) oder osmotische Einflüsse (nicht permeable Kryoprotektiva) die Zellen schädigen. Die Toxizität eines Kryoprotektivums steigt mit seiner Konzentration und Expositionszeit (Vajta et al. 2007).
Während des Einfrierens können 2 grundlegende Probleme auftreten:
  • intrazelluläre Eisbildung, wenn „zu schnell“ eingefroren wird,
  • Zerstörung durch extrazelluläre Eisbildung und hohe Konzentrationen der intrazellulären Elektrolytkonzentration, wenn „zu langsam“ eingefroren wird.
Insbesondere langsam eingefrorene Zellen sind durch Einfrierschäden potenziell beeinträchtigt (Mazur et al. 1992).
Der wichtigste limitierende Faktor des langsamen Einfrierens ist die Geschwindigkeit des Durchtritts von Wasser und Kryoprotektiva durch die Zellmembran. Diese hängt ab von
  • der Membranzusammensetzung,
  • der temperaturabhängigen Permeabilität der Zellmembran für Wasser und Kryoprotektiva (Mazur und Schneider 1986) sowie
  • dem Oberfläche/Volumen-Verhältnis (Leibo 1980; Mazur und Schneider 1986).
  • Diese Parameter gestatten eine Kalkulation der optimalen Methode für:
  • die Zugabe und Entfernung der Kryoprotektiva,
  • die Einfrier- und Auftaugeschwindigkeit
  • zur Vermeidung der intrazellulären Kristallisation (Karlsson et al. 1996; Mazur 1990).

Oozyten

Nach Publikation der ersten Geburt mit einem langsamen Einfrierprotokoll unter Verwendung von Propandiol/Sucrose und nachfolgender ICSI einer Oozyte beim Menschen (Porcu et al. 1997) gab es zahlreiche Berichte über die klinischen Ergebnisse bei Verwendung des langsamen Einfrierverfahrens. Das Interesse an der Kryokonservierung unfertilisierter Oozyten stieg noch einmal deutlich mit der zunehmenden Thematisierung der unterschiedlichen Optionen zur Fertilitätsprotektion vor relevanten Operationen, Chemotherapien und/oder einer Radiatio im kleinen Becken (Jeruss und Woodruff 2009).
Bereits 1996 veröffentlichten Tucker et al. ihre Daten und zeigten dabei eine Überlebensrate von lediglich 25 %, wobei aber die Fertilisierungsrate nach intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI) mit 65 % der aus anderen Studien entsprach (Gook et al. 1995). Erwähnenswert ist, dass sich alle regelrecht fertilisierten Zellen am Tag 3 zu qualitativ guten 4- bis 12-Zell-Embryonen entwickelt hatten. Größere Studien bestätigten niedrige Überlebensraten um die 25–50 % (Gook und Edgar 2007). In Kombination mit der Kryokonservierung unfertilisierter Oozyten wurden die Zellen nach dem Auftauen durch ICSI fertilisiert. In Zusammenfassung der bis dahin publizierten Ergebnisse implantierten sich allerdings nur 2,3 von 100 aufgetauten Oozyten (Gook und Edgar 2007).
In der Folgezeit wurde versucht, durch erhöhte Saccharosekonzentrationen (bis 0,3 M) die Dehydrierung zu verbessern. Dies resultierte in Überlebensraten der Oozyten nach dem Auftauen von 39 % (0,1 M), 58 % (0,2 M) bzw. 83 % (0,3 M; Fabbri et al. 2001). Durch eine Verlängerung der Expositionszeit in 0,2 M Saccharose ergab sich ebenfalls eine Steigerung der Überlebensraten von 55 % (5 min) auf 70 % (>10 min).
In gleicher Weise führte die Verwendung von 0,3 M Saccharose im Vergleich zu 0,1 M zu einer Überlebensrate von 71 vs. 24 %, einer Fertilisierungsrate von 80 vs. 53 % sowie Teilungsrate von 91 vs. 80 % (De Santis et al. 2007). Bianchi et al. (2007) beschrieben in ihrer Klinik eine vergleichbare Fertilisierungs- (76 vs. 80 %) und Teilungsrate (94 vs. 97 %) für kryokonservierte (0,2 M Saccharose) bzw. nicht kryokonservierte Oozyten.
Eine Zusammenfassung der Ergebnisse mit 0,2 M Saccharose (Gook und Edgar 2007) zeigte eine Überlebensrate von 72 % und eine Teilungsrate von 93 %, sodass nach dem Auftauen von 100 Oozyten sowie ICSI 53 Embryonen vorlagen. Bei einer Implantationsrate von 9,1 %/aufgetauter Oozyte war das Ergebnis deutlich besser als mit 0,1 M Saccharose.
Die Zusammenfassung der Daten mit 0,3 M Saccharose (Gook und Edgar 2007) beschreiben zwar ein vergleichbares Ergebnis von 49 Embryonen aus 100 aufgetauten Eizellen, aber eine Implantationsrate von lediglich 5 %/Embryo und 2,4 %/aufgetauter Oozyte. Etwa 1/3 der implantierten Zellen endeten aber in einem Abort.
Empfehlung
Für die Konservierung der besonders kryosensitiven unfertilisierten Oozyten stellt die Vitrifikation sicher eine optimale Alternative dar (Cobo et al. 2008; Abschn. 3).

Pronukleuszellen, Embryonen und Blastozysten

Die erfolgreiche Kryokonservierung überzähliger Embryonen nach IVF sowie die aus deren Transfer resultierende Schwangerschaft wurde erstmals bei Trounson und Mohr (1983), die erste Geburt jedoch bei Zeilmaker et al. (1984) publiziert.
Man schätzt, dass heute ungefähr 20 % der nach Maßnahmen der assistierten Reproduktion geborenen Kinder aus dem Transfer kryokonservierter – meist Embryonen im Teilungsstadium und im Stadium der Blastozysten – jedoch seltener von Oozyten stammen (Ata et al. 2010).
Die Rate an Frühgeburten, Fehlbildungen und chromosomalen Anomalien nach dem Transfer kryokonservierter Embryonen differiert nicht signifikant zum Transfer nicht kryokonservierter Embryonen (Wennerholm et al. 2009). Das galt auch für das Wachstum und die mentale Entwicklung der Kinder.
In Deutschland müssen aufgrund des Embryonenschutzgesetzes in der Routine Zellen im Pronukleusstadium kryokonserviert werden. Durch eine liberalere Auslegung des Gesetzes werden mittlerweile teilweise auch Embryonen und Blastozysten langsam programmiert eingefroren, wobei die Ergebnisse nach Vitrifikation auch hier wiederum deutliche Vorteile zeigen (Youssry et al. 2008).
Beim Vergleich der langsamen Kryokonservierung von Pronukleuszellen bzw. Blastozysten zeigten Vorkernzellen zwar eine höhere Überlebensrate, aber Blastozysten signifikant höhere Implantations-und Lebendgeburtenraten (Surrey et al. 2010).

Die Vitrifikationskomponente

Die erfolgreiche Kryokonservierung von Keimzellen in der Reproduktionsmedizin kann nunmehr auf bald 40 Jahre zurückschauen. Es ist deshalb nicht verwunderlich, dass heute die Kryokonservierung von Eizellen und Embryonen einen integralen Bestandteil der Reproduktionsmedizin darstellt. Mit mehr als 700.000 geborenen Kindern von eingefrorenen Eizellen oder Embryonen hat sich diese Technologie zwischenzeitlich weltweit etabliert und findet ihre tägliche routinemäßige Anwendung in der Mehrzahl der IVF-Labors.
Was ist das Ziel der Kryokonservierung von Gameten? Die Einlagerung in flüssigem Stickstoff mit einer Temperatur von −196 °C verlangsamt und letztendlich stoppt jegliche physikalische als auch chemische Veränderung innerhalb der Zelle, ohne diese selber nachhaltig zu schädigen.
Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, muss das Hauptaugenmerk eines jeden Kryokonservierungsprotokolls auf der Verhinderung der Eiskristallbildung gelegt werden.
Die Kristallisation während des Einfrierens kann zu unerwünschten physikalischen als auch chemischen Ereignissen führen, welche nachhaltige Schäden des biologischen Materials verursachen können. Heute beherrschen 2 Techniken das Gebiet der Kryokonservierung:
  • traditionell langsame Protokolle (Whittingham et al. 1972) und
  • Vitrifikationsprotokolle (Rall und Fahy 1985).
Um biologisches Material in flüssigem Stickstoff mit einer Temperatur von −196 °C erfolgreich einlagern zu können, muss die Abfolge der in der Übersicht genannten Schritte eingehalten werden.
Abfolge der Kryokonservierungsschritte
1.
Dehydrierung der Zelle (Wasserentzug) mit Hilfe eines Kryokonservierungsmittels
 
2.
Einfrieren und Lagern der Zelle bei −196 °C
 
3.
Rehydrierung der Zelle durch Entfernung der Kryokonservierungsmittels und Zufuhr von Wasser
 
4.
Zurückführen der Zelle in eine physiologische Umgebung (Uterus via Embryotransfer)
 
Sowohl traditionelle Einfrierprotokolle als auch Vitrifikationsprotokolle verfolgen trotz ihrer unterschiedlichen Anwendungsweise gemeinsame Ziele:
  • den Metabolismus der Zelle zu arretieren, wobei dieser Vorgang reversibel sein muss,
  • die Erhaltung der Struktur und der genetischen Integrität der Zelle,
  • akzeptable Überlebensraten nach dem Auftauen oder Erwärmen,
  • die Lieferung von zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen.
Unbestritten haben traditionell langsame Einfrierprotokolle seit ihrer erfolgreichen Etablierung 1972 einen positiven Beitrag zur Steigerung der kumulativen Schwangerschaftsraten (frisch plus kryokonservierte Zyklen) beigesteuert (Gardner et al. 2003; Van den Abbeel et al. 2005). In den vergangenen Jahrzehnten hat sich jedoch erwiesen, dass ihrem Anwendungsbereich in der Reproduktionsmedizin zunehmend Grenzen gesetzt sind.
Die ersten Versuche der Vitrifikation von Mausembryonen wurden von Rall und Fahy (1985) beschrieben. Darauf folgten weitere erfolgreiche Versuche durch Ali und Shelton (1993). Einige Jahre darauf konnten bovine Eizellen und Embryonen erfolgreich vitrifiziert und erwärmt werden (Vajta et al. 1998). Letztendlich gelang die erfolgreiche Vitrifikation von humanen Eizellen in den Jahren 1999 und 2000, die nach dem Transfer in Schwangerschaften und Lebendgeburten resultierten (Kuleshova et al. 1999; Yoon et al. 2000). Seitdem gelang es, die Überlebensraten von Eizellen und Embryonen deutlich zu verbessern (Walker et al. 2004).
Empfehlung
Diese publizierten Resultate weckten das Interesse und die Aufmerksamkeit vieler IVF-Labors weltweit, sodass die Vitrifikation heute unbestritten als eine effektive Alternative zum traditionell langsamen Einfrieren angesehen werden kann.
Belegt wird das wachsende Interesse an dieser Kryokonservierungstechnik durch die Tatsache, dass seit 1985 eine exponentielle Zunahme an Publikationen mit Bezug zur „Vitrifikation“ zu verzeichnen ist.
Trotz alledem sehen noch heute viele Embryologen (oft wegen fehlender eigener Erfahrungen mit der Vitrifikation) die Verwendung von hohen Konzentrationen an Kryokonservierungsmittel als Nachteil dieser Technik an. Dieses Vorurteil beruht auf der Erwartung, dass mit steigender Konzentration des Kryokonservierungsmittels auch seine Toxizität ansteigt. Mit dem zunehmend besseren Verständnis der physikalischen und auch biologischen Prinzipien dieser Technik (Vanderzwalmen et al. 2013) hat die Vitrifikation daher zunehmend an Popularität gewonnen und sich v. a. Hilfe zahlreicher klinischer Anwendungen einen festen Platz in der Reproduktionsmedizin verschafft.

Grundlagen

Obwohl bereits 1985 die erfolgreiche Vitrifikation von Mausembryonen publiziert wurde, fand diese Technik zuerst eine nur geringe Verbreitung in der Reproduktionsmedizin. Die Vitrifikation als Kryokonservierungsmethode von biologischem Material stellt jedoch eine der aufregendsten Entwicklungen der vergangenen Jahre in der Reproduktionsmedizin dar.
Bei sorgfältiger Anwendung der Vitrifikation kann die Eiskristallbildung während des Einfrierens durch Bildung einer amorphen Glasphase gänzlich verhindert werden. Hierbei gelingt es auch, jegliche Abläufe auf molekularer Ebene zu arretieren („state of suspended animation“).
Definition Vitrifikation
Die Vitrifikation einer Lösung ist definiert als die „Solidifikation von Wasser ohne Eiskristallbildung bei Temperaturen weit unter 0 °C, verursacht durch eine extreme Erhöhung der Viskosität der Lösung während des Abkühlens“ (Fahy et al. 1984; Fahy 1986).
Durch sehr schnelles Abkühlen des Wassers konvertiert die Lösung in einen glasähnlichen amorphen Aggregatzustand ohne jegliche kristalline Strukturen. Um in- und außerhalb der Zelle eine glasähnliche Solidifikation zu erreichen und toxische sowie osmotische Verletzungen zu minimieren, müssen die folgenden Punkte beachtet werden:
  • Einsatz hoher Kühlraten (>2500 °C/min) und die Verwendung einer hohen Konzentration an Kryokonservierungsmittel (15 % v/v).
  • Einsatz von Trägersystemen, deren Material eine hohe Wärmeleiteigenschaft oder einen niedrigen Isolierungsindex aufweist.
  • Einsatz einer Mixtur, bestehend aus 2 Kryokonservierungsmitteln, um die spezifische Toxizität jedes einzelnen Kryokonservierungsmittels zu erniedrigen.
  • Kombinierter Gebrauch von permeablen und nicht permeablen Kryokonservierungsmitteln
  • Schrittweise Zugabe der Kryokonservierungsmittel.
  • Erniedrigung der Temperatur während der Inkubation der Zellen in der hoch konzentrierten Vitrifikationslösung.
  • Verwendung eines in den Nanoliter-Bereich gehenden Volumens.
  • Einsatz hoher Wärmeraten (dominierende Rolle im Vergleich zu hoher Kühlraten).
Die Bedeutung der Verwendung eines kleinen Volumens, auch als „minimal volume approach“ bezeichnet, wurde 2005 erstmals beschrieben und publiziert (Kuwayama et al. 2005; Kuwayama 2007). Als Grundregeln für die Vitrifikation gelten die in der Übersicht genannten Punkte (Seki und Mazur 2009; Mazur und Seki 2011).
Grundregeln für die Vitrifikation
  • Je höher die Kühlrate, umso niedriger kann die Konzentration des Kryokonservierungsmittels gewählt werden.
  • Dominanz von Erwärmungsraten gegenüber Kühlraten für eine gute Überlebensrate nach der Vitrifikation.
Neben dem bereits oben Erwähnten existiert eine weitere Vielzahl an Variablen, welche nachhaltig den Erfolg und die Überlebensrate des biologischen Materials beeinflussen können. Aufgrund der nachfolgend aufgelisteten Gründe ist ein Standardvitrifikationsprotokoll sowohl für Eizellen als auch Embryonen ungeeignet, weil
  • Eizellen und Embryonen ein unterschiedliches Verhältnis zwischen Oberfläche und Volumen aufweisen,
  • Eizellen, Zygoten, Teilungsstadien und Blastozysten unterschiedliche Kühl- und Erwärmungsraten erfordern, um einen Erfolg zu garantieren und
  • die verschiedensten Zellstadien eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Kälte aufweisen.
  • Das heute am weitesten verbreitete Protokoll, das sich für Eizellen und die unterschiedlichsten Entwicklungsstadien eignet, besteht aus 2 Schritten:
  • Equilibrierung der Zelle (Dehydrierung) in einer Mixtur, bestehend aus gleiche Anteilen von 7,5 % (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) und Ethylenglykol (EG),
  • Vitrifikationslösung von 15 % (v/v), versetzt mit 0,5 M Zucker und 20 % Protein.
Eiskristalle sind letal für jedes biologische Material. Die Bildung von Eiskristallen wird durch den Einsatz von Kryokonservierungsmitteln („cryoprotectant agents“) unterbunden. Die Inkubation der Zelle in einem Kryokonservierungsmittel bewirkt die Entfernung von intrazellulärem Wasser aus dem Zytoplasma via Osmose (passiv) oder Wasserkanälen (Aquaporine; aktiv). Man unterscheidet zwischen nicht permeablen Kryokonservierungsmitteln (nicht membrangängig) mit einem großen Molekulargewicht um die 300–400 (Saccharide, Proteine, Polymere) oder permeablen Kryokonservierungsmitteln (membrangängig) mit einem Molekulargewicht von <100 wie Glyzerol, Ethylenglykol (EG), Dimethylsulphoxid (DMSO).
Die membrangängigen Gefrierschutzmittel binden das intrazelluläre Wasser und verhindern damit die Formation von Eiskristallen. An dieser Stelle muss betont werden, dass Kryokonservierungmittel bei nicht sachgerechter Anwendung toxische Nebenwirkungen auf die Zelle ausüben können. Daraus resultieren beispielsweise osmotische Schäden oder Schäden an intrazellulären Kompartimenten. Erwähnenswert ist, dass in kürzlich erschienenen Publikationen (Takahashi et al. 2005; Liebermann und Tucker 2006; Liebermann 2009, 2011) bei Verwendung relativ hoher Konzentrationen an DMSO keine negativen Effekte auf die Lebendgeburtenrate beobachtet werden konnten.
Zusammenfassend lässt sich Folgendes feststellen (Tucker 2003; Liebermann und Tucker 2004):
Mit der Vitrifikation steht eine einfache Technologie zur Verfügung, die sich schnell in ein IVF-Labor integrieren lässt. Sie ist relativ billig, etabliert sich zunehmend in vielen IVF-Zentren weltweit und scheint bei sachgerechter Anwendung zuverlässiger zu sein als das langsame Einfrieren.
Im Folgenden werden kurz die praktische Durchführung der Vitrifikation und der Erwärmung von Zellen besprochen.
Dehydrierung
Die Dehydrierung der Zelle beginnt mit einer Inkubation der Zellen in 7,5 % EG/DMSO + 20 % Protein. Hierbei hängt die Dauer der Inkubation vom Zelltyp ab:
lang > – Eizelle – Zygote – Tag 3 Embryonen – Tag 5 Blastozysten – < kurz
Daran schließt sich eine Inkubationsdauer von 60–70 s in 15 % EG/DMSO + 0,5 M Zucker + 20 % Protein an. Der Einsatz eines Zuckers unterstützt die Dehydrierung während der Vitrifikationsprozedur. Im Anschluss daran werden die Zellen auf ein Trägersystem („carrier“) aufgebracht und dann direkt (offenes System) oder erst nach Verschluss des Trägersystems (geschlossenes System) in flüssigen Stickstoff (LN2) eingetaucht.
Empfehlung
Wichtig ist, dass die Zellen in einem sehr kleinen Volumen der Vitrifikationslösung auf das Trägersystem aufgetragen werden.
Rehydrierung
Die Rehydrierung erfolgt in 3 Schritten. Nach der Entnahme aus dem LN2 werden die Zellen zuerst in eine 1-M-Zuckerlösung gebracht. Dem schließt sich eine Inkubation in 0,5 M Zucker an, bis letztendlich im abschließenden Schritt die Zellen in einer zuckerfreien Lösung inkubiert werden.
Die Verwendung einer Zuckerlösung wahrend des Erwärmens erlaubt einen kontrollierten Austausch von Kryokonservierungsmittel und Wasser. Dies bedeutet, dass die Zelle nur sehr langsam expandiert und schwillt, was sich positiv auf die Überlebensrate niederschlägt. Des Weiteren wirkt der nicht membrangängige Zucker als osmotischer Puffer, indem er osmotischen Schock auf die Zelle reduziert. Die hohe Zuckerkonzentration kann das Schwellen der Zelle nicht völlig verhindern, aber die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Schwellung reduzieren (Liebermann et al. 2002a, 2003).

Vitrifikation von Eizellen

Die erfolgreiche Kryokonservierung von menschlichen Eizellen stellt einen bedeutsamen Schritt in der Reproduktionsmedizin dar, insbesondere, wenn man bedenkt, dass es über mehr als 2 Jahrzehnte nicht gelang, das Einfrieren von Eizellen als klinische Anwendung zu etablieren. Erst mit Hilfe der Vitrifikation als Alternative zu den traditionell langsamen Einfrierprotokollen wurde es möglich, menschliche Metaphase-II-Eizellen mit gleichbleibendem Erfolg einzufrieren.
Die erste Lebendgeburt unter Verwendung von Vitrifikationsprotokollen gelang Kuleshova et al. (1999). Obwohl die Kryokonservierung von Eizellen historisch betrachtet eine geringe Effizienz aufwies (niedrige Überlebens-, Befruchtungs- und Teilungsrate), liegen heute Information von über 2000 Kindern vor.
Trotz alledem stellt sich die Frage, was die Eizellen neben ihrer Zellgröße und reduzierten Membrandurchgängigkeit von Teilungsstadien unterscheidet?
  • Hier ist einerseits ein geringes Verhältnis zwischen Volumen und Zelloberfläche zu nennen.
Daher sind Eizellen sowohl in Bezug auf die Aufnahme des Gefrierschutzmittels als auch die Abgabe von Wasser weniger effizient. Weitere Unterschiede sind:
  • Die maternale DNA liegt im Zytoplasma an der Kernspindel an und ist nicht durch eine Kernmembran geschützt. Eine Schädigung von DNA und Mikrotubuli während des traditionell langsamen Einfrierens könnte den begrenzten Erfolg über so viele Jahre erklären.
  • Die Eizelle ist in einem Zustand unmittelbarer Aktivierung arretiert.
  • Veränderungen in der Umgebung der Eizelle wie z. B. niedrige Temperaturen können zu einer parthenogenetischen Aktivierung führen.
Das Einfrieren von Eizellen kann die Fertilität von Frauen sichern, die
  • sich einer Chemotherapie unterziehen müssen,
  • ihren Kinderwunsch aufgrund von Karriere, Partnerschaftstatus oder psychologischen, emotionalen Gründen zeitlich verzögern.
  • Ein weiterer Grund wäre die am Tag der Eizellentnahme erfolglose Masturbation oder Azoospermie.
Obwohl im Vergleich zu geborenen Kindern aus langsam eingefrorenen Eizellen die Geburt des ersten Babys von vitrifizierten Eizellen viel später gelang (ca. 13 Jahre später), hat die Zahl geborener Kinder längst diejenige nach langsamer Kryokonservierung übertroffen. Alle diese Neugeborenen zeigten kein erhöhtes Risiko kongenitaler Anomalien (Noyes et al. 2009). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Vitrifikation von Eizellen nicht das Risiko für ein abnormales Imprinting oder Veränderungen in der Spindelformation oder Anordnung der Chromosomen an der Spindelplatte erhöht (Trapphoff et al. 2010).
Anhand der bisher vorliegenden Daten wurde keine signifikante Zunahme genetischer Auffälligkeiten der Kinder aus kryokonservierten Eizellen beobachtet (Chian et al. 2009).
Dies ist umso erwähnenswerter, als bekannt ist, dass die Kryokonservierung von reifen Metaphase-II-Eizellen den meiotischen Spindelapparat separiert und dadurch ein erhöhtes Aneuploidierisiko der resultierenden Embryonen bestehen könnte. Wissenschaftliche Studien haben gezeigt, dass eingefrorene Eizellen keine Chromosomenanomalien aufweisen (Gook und Edgar 1999). Eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung von Embryonen aus frischen und eingefrorenen Eizellen fand keinen Unterschied im Grad der Aberrationen (Cobo et al. 2001). Es ist eine bekannt, dass die meiotische Spindel sich nach dem Erwärmen wieder adäquat und unabhängig von der Kryokonservierungstechnik reformiert (Chen et al. 2004; Bianchi et al. 2005; Larman et al. 2007).
Die wissenschaftliche Literatur über die Eizellkryokonservierung wächst täglich. Die meisten Publikationen fokussieren auf die Verbesserung klinischer Schwangerschaften (Boldt et al. 2003, 2006), wobei die hierbei erzielten und publizierten Daten das Vertrauen in diese Technik untermauern.

Vitrifikation von Vorkernstadien

Das Einfrieren von Vorkernstadien (Zygoten) unter Verwendung von traditionell langsamen Einfrierprotokollen ist seit Jahren, besonders in Ländern wie Deutschland, das die Kryokonservierung von menschlichen Embryonen nach Kernverschmelzung per Gesetz untersagt, etabliert.
Etwa 98 min werden benötigt, um Zygoten per traditionellem Protokoll einzufrieren. Die klinischen Schwangerschaftsraten belaufen sich auf 18 % mit einer Implantationsrate (IR) von 10 % per transferiertem Embryo. Im Gegensatz dazu benötigt die Vitrifikation von Zygoten ca. 12 min.
Die Überlebensrate vitrifizierte Zygoten liegt bei >90 % mit einer Teilungsrate von 80 % am Tag 2, einer Blastozystenformationsrate am Tag 5 > 30 % (Park et al. 2000; Jelinkova et al. 2002; Liebermann et al. 2002b; Al-Hasani et al. 2007). Al-Hasani et al. (2007) publizierten klinische Schwangerschafts- und Implantationsraten von 30 % und 17 %. Das Vorkernstadium durchläuft nach der Befruchtung signifikante Veränderungen der Membranpermeabilität, die wiederum verantwortlich dafür sind, dass das Oolemma der Zygote mehr Stabilität aufweist. Des Weiteren können Vorkernzellen einen Kälteschock und osmotische Veränderungen während der Vitrifikation und Erwärmung besser tolerieren.

Vitrifikation von Teilungsstadien

Über die Vitrifikation von Embryonen liegen zahlreiche Publikationen vor. Abhängig von der Wahl des Trägersystems demonstrierten Liebermann und Tucker (2002) Überlebensraten von 80–90 %. Gute Teilungsraten und eine Morulabildung in >30 % wurden beobachtet. Weitere Publikationen bestätigten diese Ergebnisse (Mukaida et al. 1998). Die Überlebensrate von Embryonen nach langsamem Einfrieren oder Vitrifikation liegen vergleichbar um die 75–80 % (Jericho et al. 2003). Erfolgreiche Schwangerschaften und Lebendgeburten von vitrifizierten Teilungsstadien wurden beschrieben (El-Danasouri und Selman 2001; Selman und El-Danasouri 2002; Rama Raju et al. 2005; Desai et al. 2007). Trotz der Tatsache, dass gute Überlebensraten erreicht wurden (Liebermann und Tucker 2002), entwickelten sich nur ca. 35 % der erwärmten Teilungsstadien zum Morulastadium.
Loutradi et al. (2008) publizierten eine Metaanalyse und einen systematischen Review zur Kryokonservierung von Teilungsstadien unter Verwendung von traditionellen langsamen vs. Vitrifikationsprotokollen und fanden eine Überlebensrate von 84 % vs. 97 %. Vitrifikationsprotokolle zeigten sich aber auch im Vergleich mit traditionell langsamen Protokollen hinsichtlich klinischer Schwangerschafts- (48 % vs. 35 %) und Implantationsraten (39 % vs. 15 %) deutlich überlegen (Rama Raju et al. 2005; Desai et al. 2007; Li et al. 2007; Balaban et al. 2008).
Schlussfolgernd kann festgestellt werden, dass Vitrifikationsprotokolle für Teilungsstadien einen positiven Einfluss auf das gesamte weitere Outcome besitzen.
Rama Raju et al. (2009) verglichen Neugeborene aus vitrifizierten Teilungsstadien mit Neugeborenen aus frisch transferierten Teilungsstadien und fanden keine signifikante Erhöhung kongenitaler Anomalien.

Vitrifikation von Blastozysten

Zahlreiche Schwangerschaften und Lebendgeburten von vitrifizierten menschlichen Blastozysten mit unterschiedlichen Trägersystemen wurden publiziert (Mukaida et al. 2003a, b; Son et al. 2003; Liebermann 2015). Die Blastozyste ist ebenso wie die unbefruchtete Eizelle besonders empfindlich gegenüber niedrigen Temperaturen. Ihre Besonderheit liegt im flüssigkeitsgefüllten Blastozoel. Es ist bekannt, dass die Überlebensrate nach Vitrifikation mit zunehmendem Volumen des Blastozoels abnimmt (Mukaida et al. 2006). Eine mögliche Ursache dafür könnte eine nicht ausreichende Permeation des Kryokonservierungsmittels sein, sodass intrazellulär Restwasser verbleibt, das dann kristallisiert. Hilfreich ist die artifizielle Reduktion des Blastozoels vor der Vitrifikation (Vanderzwalmen et al. 2002; Hiraoka et al. 2004; Liebermann und Conaghan 2013). Sowohl lwayama et al. (2011) als auch Hur et al. (2011) erzielten höhere Implantationsraten und klinische Schwangerschaftsraten, nachdem die Größe des Blastozoels vor der Vitrifikation reduziert wurde. Alle hier zitierten Literaturstellen kommen zu dem Schluss, dass ein Kollapieren des Blastozoels vor der Vitrifikation die Schwangerschaftsraten von transferrierten vitrifizierten und erwärmten Blastozysten erhöht und somit auch die kumulative Schwangerschafts- und Implanationsrate.
Nach Vitrifikation menschlicher Blastozysten unter Anwendung von Cryoloops betrug die Überlebensrate 72–90 %, die klinische Schwangerschaftsrate 37–53 % und die Implantationsrate 22–30 % (Mukaida et al. 2001, 2003a, b; Vanderzwalmen et al. 2002, 2003; Liebermann und Tucker 2006; Liebermann 2009, 2011, 2015).
Die Aktivierung des embryonalen Genoms erfolgt im 8-Zell-Stadium ungefähr 3 Tage nach Eizellentnahme (Braude et al. 1988). Ohne diese Aktivierung würde der Embryo sich nicht weiterentwickeln und somit nicht überleben.
Somit ist eine Identifizierung der Embryonen essenziell, die sich nach embryonaler Genomaktivierung weiterentwickeln. Die Kultivierung zum Blastozystenstadium (ca. 5 Tage nach Eizellentnahme) erlaubt den Transfer von Embryonen, die definitiv eine Weiterentwicklung nach Aktivierung des fetalen Genoms aufweisen.
Weitere Vorteile des Transfers sowie der Kryokonservierung menschlicher Embryonen im Blastzystenstadium sind:
  • Transfer am Tag 5 erlaubt eine Reduktion der Anzahl der zu transferierenden Embryonen, was zu einer Reduktion von Zwillings- und Drillingsschwangerschaften und damit verbundenen Komplikationen führt.
  • Im Blastozystenstadium kryokonservierte Embryonen liefern eine erhöhte Schwangerschafts- und Implantationsrate per aufgetautem, transferiertem Embryo.
  • Ungefähr 120 h nach Eizellentnahme (Tag 5 der Zellkultur) besitzt das menschliche Blastozystenstadium ungefähr 50–150 Zellen. Diese hohe Zellzahl erlaubt eine bessere Kompensation von Kälteschäden, was wiederum in einer schnelleren Erholung und besseren Überlebensrate des Embryos resultiert.
  • Das zytoplasmatische Volumen jeder einzelnen Zelle ist aufgrund des Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen niedrig, was wiederum eine schnellere Penetration des Kryokonservierungsmittels ermöglicht.
  • Obwohl weniger Embryonen pro Patientin eingefroren werden, besitzt jede dieser vitrifizierten Blastozysten nach dem Erwärmen ein deutlich höheres Implantationspotenzial als vergleichsweise Vorkern- oder Teilungsstadien.
Vitrifikation von Blastozystem am Fertility Centers of Illinois
Menschliche Blastozysten werden seit 2004 in den Fertility Centers of Illinois mit einem „offenen“ (Cryotop; Kitazato Bio Pharma Co. Ltd., Fuji-shi, Japan), oder seit 2007 mit einem „geschlossenen“ Trägersystem (HSV [High Security Vitrification Kit]; CryoBio System, L’Aigle, Frankreich) bei 24 °C vitrifiziert. Vor der eigentlichen Vitrifikation wird das Blastozoel mit Hilfe eines Lasers zum Kollapieren gebracht. Dies geschieht, indem die Schale mit der Blastozyste unter ein Mikroskop, welches mit einem Laser (LYKOS, Hamilton Thorne) ausgestattet ist, gebracht wird. Eine Zellverbindung zwischen zwei Trophektoderm-Zellen wird lokalisiert und ein Laserpuls mit 100 % Energie und 500 μs Puls Länge wird ausgelöst. Unmittelbar danach wird die Kulturschale mit der Blastozyste dann für weitere 5 min zurück in den Inkubatorschrank gebracht. Nach Ablauf der 5 min kann mit der Vitrifikation wie folgt begonnen werden: Die Blastozysten werden zuerst in einer Äquilibrierungslösung inkubiert (M199 mit 20 % Serum Supplement Substitution [SSS], 7,5 % [v/v] Ethylenglykol [EG] und 7,5 % [v/v] Dimthylsulfoxid [DMSO]). Nach 8 min werden die Blastozysten dann für 60 s in der Vitrifikationslösung inkubiert (15 % [v/v] DMSO, 15 % [v/v] EG, 0,5 M Sucrose) und dann mit einem kleinen Volumen (<1 μl) auf das Trägersystem geladen, in flüssigen Stickstoff eingetaucht und gelagert. Das „geschlossene“ System wird zuerst verschweißt, dann in flüssigen Stickstoff eingetaucht und gelagert.
Das Erwärmen der Blastozysten erfolgt ungefähr 1–2 Stunden vor dem Transfer. Das Verfahren des Erwärmens der Blastozysten und Entfernen des Kryokonservierungsmittels erfolgt in drei Schritten. Beide Trägersysteme werden nach Entnahme aus dem flüssigen Stickstoff unmittelbar in eine 37 °C warme 1,0-M-Zuckerlösung eingetaucht. Hierbei werden die Blastozysten vom Trägersystem genommen und nun in 24 °C warme 1,0-M-Zuckerlösung eingetaucht. Nach 5 min werden die Blastozysten in 0,5-M-Zuckerlösung und nach weiteren 5 min in ein zuckerfreies Medium überführt und gewaschen. Aufgrund des bekannten Phänomens, genannt „zona hardening“, welches eine durch die Kryokonservierung herbeigeführte Strukturveränderung der Zona-Proteine (Larman und Sheehan 2006) beinhaltet, und aufgrund erst kürzlich publizierter Daten (Conaghan und Vaccari 2015) wurden alle erwärmten Blastozysten einer Prozedur, genannt „assisted hatching“, unterworfen. Hierbei wird mit Hilfe eines Lasers ungefähr 30 % der Zona entfernt. Anschließend werden die Blastozysten im Kulturmedium bis zum Transfer aufbewahrt. Sowohl natürliche als auch Hormonersatzzyklen wurden durchgeführt, um die Rezeptivität des Endometriums zu verbessern. Progesteron wurde supplementiert am Tag 15 des Zyklus, und die Blastozysten wurden erwärmt am 6. Tag der Progesteron-Supplementation.
Über einen Zeitraum von 2004 bis 2016 wurden in den Fertility Centers of Illinois „IVF Labor River North“ (Chicago) 33.476 Blastozysten von 8289 Patienten mit einem Durchschnittsalter von 34,6 ± 6,0 Jahren vitrifiziert. Die Mehrheit der Blastozysten wurde am Tag 5 vitrifiziert (55 %), 43,5 % am Tag 6 und eine Minderheit von 1,5 % am Tag 7 (Tab. 1).
Tab. 1
Retrospektive Daten von 8289 Patientinnen (Durchschnittsalter 34,6 ± 6,0 Jahre) mit Blastozystenvitrifikation von 2004–2016
Entwicklungstag
Tag 5
Tag 6
Tag 7
Gesamt
Vitrifizierte Blastozysten (n)
18495
14505
476
33476
Vitrifizierte Blastozysten (%)
55 %
43,5 %
1,5 %
 
Nach 13 Jahren der Vitrifikation von Blastozysten unter der Anwendung eines offenen Systems (Cryotop) und eines geschlossenen Systems (HSV; High Security Vitrification System) wurde in 6706 Transfers mit einem Durchschnitt von 1,7 Blastozysten pro Transfer folgendes pränatales Ergebnis erreicht: Aus 1914 Entbindungen wurden 2336 Kinder (1203 Mädchen und 1133 Jungen) geboren (Tab. 2). Es wurden keine nennenswerten Abnormalitäten registriert.
Tab. 2
Pränatale Daten (2004–2016) von vitrifizierten Blastozysten nach 6706 Transfers (Babys entbunden bis Januar 2015)
Entwicklungstag
Tag 5 + Tag 6
Tag 5
Tag 6
Tag 7
Entbindungen (total)
1914
1264
641
9
Kinder geboren (total)
2336
1555
771
10
Mädchen
1203
813
386
4
Jungen
1133
742
385
6
Einlinge
1502 (78,5)
979 (77,5)
515 (80,0)
8 (89,0)
Zwillinge
402 (21,0)
279 (22,0)
122 (19,0)
1 (11,0)
Drillinge
10 (0,5)
6 (0,5)
4 (1,0)
In Tab. 3 werden Daten zusammengefasst, welche an Schwangerschaftsdauer und Geburtsgewicht von 1363 geborenen Kindern erhoben wurden. 926 Kinder waren von vitrifizierten und erwärmten Tag-5- und Tag-6-Blastozysten-Transfers (VBT), während 437 Kinder nach einem frischen Transfer von einem Embryo (selektiver Transfer von einer Tag-5-Blastozyste, SFBT) geboren wurden. Wenn Kinder von vitrifizierten und erwärmten Tag-5- (n = 561) und Tag-6-Blastozysten (n = 365) in Bezug auf Schwangerschaftsdauer und Geburtsgewicht mit Hilfe eines T-Tests verglichen wurden, wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede (p = 0,71 und p = 0,124) festgestellt. Bekanntlich korreliert die Schwangerschaftsdauer mit dem Geburtsgewicht, jedoch wurden keine Unterschiede zwischen SFBT und VBT beobachtet. Tab. 3 zeigt jedoch auch, dass mit Hilfe des One-way ANOVA-Tests ein signifikanter Unterschied (p = 0,013) im Geburtsgewicht zwischen SFBT und VBT gefunden wurde. Tendenziell zeigte die VBT-Gruppe ein höheres Geburtsgwicht. Diese Daten bestätigen früher publizierte Beobachtungen von Pinborg et al. (2014). Tab. 3 zeigt auch, dass Chi-Square keinen signifikanten Unterschied in der prozentualen Verteilung von Mädchen und Jungen geboren nach vitrifizierten, erwärmten oder frisch transferrierten Embryonen (χ2; p = 0,2454) finden konnte. Wurden die beiden Geschlechter von frischen und vitrifizierten und erwärmten Transfers kombiniert, konnte mit Hilfe eines T-Tests ein signifikanter, aber auch ein zu erwartender Unterschied im Geburtsgewicht zwischen Jungen und Mädchen gemessen werden (p <0,001) (Tab. 4). Jungen waren im Durchschnitt 157,2 g schwerer als Mädchen. Zusammenfassend wurde beoachtet, dass 110 Kinder ein Geburtsgewicht von weniger als 2500 g hatten (definiert als niedriges Geburtsgewicht) und 159 Kinder ein Geburtsgewicht zwischen 4000 und 4500 g (definiert als hohes Geburtsgwicht), während 33 Kinder ein Gewicht von mehr als 4500 g (definiert als Makrosomia) aufwiesen (Tab. 4).
Tab. 3
Geburtsgewicht (GW) und Schwangerschaftsdauer (SD) von Kindern (n = 1363) geboren nach einem frischen Transfer einer Blastozyste am Tag 5 (SFBT; n = 437) im Vergleich zu Kindern geboren nach einem Transfer von vitrifizierten und erwärmten Blastozysten (VBT; n = 926) und in Abhängigkeit vom Tag der Embryonalentwicklung (Tag 5 vs. Tag 6)
 
SFBT – Tag 5
VBT – Tag 5 + Tag 6
VBT – Tag 5
VBT – Tag 6
Patientendurchschnittsalter (Jahre)
31,1 ± 3,1c
34,7 ± 4,9c
34,7 ± 5,0
34,8 ± 4,8
Geburten
437
926
561
365
Mädchen
238a
479a
288
191
Jungen
199a
447a
273
174
SD
38,1 ± 2,5a
37,9 ± 2,7a
38,0 ± 2,6a
37,9 ± 2,9a
GW (g)
3294,9 ± 609,4b
3390,1 ± 710,6b
3419,1 ± 712,6a
3345,5 ± 705,8a
T-Test (Satterthwaite-Unequal variance) & χ2 Test: aP >0,05; bP = 0,013; cP <0,001
Tab. 4
Prozentuale Verteilung (%) des Geburtsgewichtes (GW) von Kindern (n = 1363) geboren nach einem frischen Transfer einer Blastozyste am Tag 5 (SFBT; n = 437) im Vergleich zu Kindern geboren nach einem Transfer von vitrifizierten und erwärmten Blastozysten (VBT; n = 926) und Vergleich von Schwangerschaftsdauer (SD) und gechlechtsbezogenem Geburstsgewicht (GW) nach frischem und vitrifiziertem erwärmtem Embryo-Transfer
 
SFBT – Tag 5 (n) [%]
VBT – Tag 5 + Tag 6 (n) [%]
Total (n) [%]
GW (g) <2500
34 [7,8]
76 [8,2]
110
GW (g) ≥4000
38 [8,7]
154 [16,6]
192
GW (g) ≥400 and ≤4500
32 [7,3]
127 [13,7]
159
GW (g) >4500
6 [1,4]
27 [2,9]
33
Geschlecht
Mädchen von SFBT und VBT
Jungen von SFBT und VBT
N
717
646
GA (weeks)
37,9 ± 2,6a
38,0 ± 2,6a
LBW (g)
3284,1 ± 663,8b
3441,3 ± 691,0b
Prozentdarstellung in Klammern. T-test & χ2 Test: aP >0,05; bP <0,001
Tab. 5 und 6 zeigen klinische Daten von vitrifizierten und erwärmten Blastozysten entsprechend ihrem Entwicklungsstadium (Tag 5 und Tag 6) und von Patienten mit Donor-Rezipient-Zyklen. Bei Patientinnen jünger als 35 Jahre ergaben sich folgende Daten (Transfer von Tag-5-Blastozysten, n = 1977 vs. Transfer von Tag-6-Blastozysten, n = 1032): Überlebens-, Implantations- und klinische Schwangerschaftsrate: 98,4 % vs. 97,7 %, 45,1 % vs. 32,4 % und 56,0 % vs. 44,0 %.
Tab. 5
Retrospektive Outcome-Daten (2004–2016) des offenen/geschlossenen Blastozysten-Vitrifikationsprogramms (Fertility Centers of Illinois, Chicago) von vitrifizierten und erwärmten Tag-5-Blastozysten in Abhängigkeit vom Alter der Patientin; ebenfalls dargestellt sind die Outcome-Daten nach Eizellspende (Spalte Donor)
Patientenalter
<35
35–37
38–40
>40
Donor
Anzahl der Zyklen
1978
895
587
307
355
Anzahl der Transfers
1977
894
585
306
355
Überlebensrate der Blastozysten (%)
98,4
98,7
98,8
98,7
99,0
Durchschnittliche Anzahl transferierter Blastozysten pro Patientin (%)
1,6
1,6
1,7
1,7
1,7
Schwangerschaftsrate pro Transfer (%)
64,9
62,9
60,5
59,8
62,8
Klinische Schwangerschaftsrate pro Transfer (%)
56,0
52,0
49,0
48,0
53,0
Rate fortlaufender Schwangerschaften pro Transfer (%)
49,2
44,0
39,0
37,0
41,0
Anzahl der Implantationen
1442
585
355
173
240
Implantationsrate (%)
45,1
42,0
36,5
34,3
40,5
Tab. 6
Retrospektive Outcome-Daten (2004–2016) des offenen/geschlossenen Blastozysten-Vitrifikationsprogramms (Fertility Centers of Illinois, Chicago) von vitrifizierten und erwärmten Tag-6-Blastozysten in Abhängigkeit vom Alter der Patientin; ebenfalls dargestellt sind die Outcome-Daten nach Eizellspende (Spalte Donor)
Patientenalter
<35
35–37
38–40
>40
Donor
Anzahl der Zyklen
1039
579
451
316
178
Anzahl der Transfers
1032
574
448
314
177
Überlebensrate der Blastozysten (%)
97,7
98,7
98,2
97,0
99,7
Durchschnittliche Anzahl transferierter Blastozysten pro Patientin (%)
1,7
1,6
1,7
1,6
1,7
Schwangerschaftsrate pro Transfer (%)
52,6
48,4
48,0
45,5
46,3
Klinische Schwangerschaftsrate pro Transfer (%)
44,0
41,0
40,0
35,0
38,0
Rate fortlaufender Schwangerschaften pro Transfer (%)
36,0
33,0
31,0
24,0
27,0
Anzahl der Implantationen
579
291
224
124
79
Implantationsrate (%)
32,4
30,6
29,5
24,4
26,6
In 2007 erfolgte ein Wechsel des Trägersystems von einem „offenen“ zu einem geschlossenen, aseptischen System (High Security Vitrification Kit). Seitdem wurden folgende Überlebens-, Implantations- und klinische Schwangerschaftsraten erzielt: 99,0 %, 39,3 % und 50,1 % (Tab. 7).
Tab. 7
Retrospektive Daten (Oktober 2007–2016) des aseptischen Blastozysten-Vitrifikationsprogramms (Fertility Centers of Illinois, Chicago) von vitrifizierten und erwärmten Tag-5-, Tag-6- und Tag-7-Blastozysten
Technik
Vitrifikation
Patientinnenalter (Jahre)
35,7 ± 4,9
Anzahl der Transfers
5575
Anzahl der erwärmten Blastozysten
9102
Anzahl der überlebenden Blastozysten (%)
9011 (99,0)
Anzahl der transferierten Blastozysten
8856
Durchschnittliche Anzahl transferierter Blastozysten pro Patientin
1,6
Anzahl der Implantationen (%)
3483 (39,3)
Anzahl positiver Schwangerschaften pro Transfer (%)
3334 (59,8)
Anzahl klinischer Schwangerschaften pro Transfer (%)
2795 (50,1)
Fortlaufende Schwangerschaften pro Transfer (%)
2309 (41.4,
Anzahl der Lebendgeburten
1726
Tab. 8 zeigt klinische Daten von vitrifizierten und erwärmten Blastozysten entsprechend ihrem Entwicklungsstadium (Tag 5, n = 3552; Tag 6, n = 1979; Tag 7, n = 44). Folgende Daten (Transfer von Tag-5-Blastozysten vs. Transfer von Tag-6-Blastozysten vs. Transfer von Tag-7-Blastozysten): Überlebens-, Implantations- und klinische Schwangerschaftsrate: 99,2 % vs. 98,76 % vs, 97,3 %, 44,0 % vs. 31,9 % vs. 12,5 % und 54,8 % vs. 42,5 % vs. 18,2 %.
Tab. 8
Retrospektive Daten (Oktober 2007–2016) des aseptischen Blastozysten-Vitrifikationsprogramms (Fertility Centers of Illinois, Chicago) von vitrifizierten und erwärmten Tag-5-, Tag-6- und Tag-7-Blastozysten in Abhängigkeit vom Entwicklungstadium der Embryonen
Entwicklungstag
Tag 5
Tag 6
Tag 7
Patientinnenalter (Jahre)
35,3 ± 4,9
36,2 ± 4,8
36,0 ± 4,1
Anzahl der Transfers
3552
1979
44
Anzahl der erwärmten Blastozysten
5679
3349
74
Anzahl der überlebenden Blastozysten (%)
5635 (99,2)
3304 (98,7)
72 (97,3)
Anzahl der transferierten Blastozysten
5546
3238
72
Durchschnittliche Anzahl transferierter Blastozysten pro Patientin
1,6
1,6
1,6
Anzahl der Implantationen (%)
2440 (44,0)a
1034 (31,9)a
9 (12,5)a
Anzahl positiver Schwangerschaften pro Transfer (%)
2297 (64,7)b
1023 (51,7)b
14 (31,8)b
Anzahl klinischer Schwangerschaften pro Transfer (%)
1947 (54,8)c
840 (42,5)c
8 (18,2)c
Fortlaufende Schwangerschaften pro Transfer (%)
1643 (46,3)d
659 (33,3)d
7 (15,9)d
Anzahl der Lebendgeburten
1200
520
6
Prozent dargestellt in Klammern. χ2; aP >0,05; bP <0,001; a,b,c,dP <0,001
Zwischen 2007 und 2016 führte das Fertility Centers of Illinois (Chicago) 2765 Transfers mit vitrifizierten und erwärmten Blastozysten durch, ohne das Blastcoel vor der Vitrifikaton zu kollapieren (Gruppe A), wohingegen in 2765 Transfers das Blastocoel vor der Vitrifikation kollapiert wurde (Gruppe B). Wurden die vitrifizierten und erwärmten Transfers eingeteilt in Tag-5- und Tag-6-Blastozysten, wurden folgende Daten erfasst (Tab. 9): in 1622 Tag-5-Blastozysen-Transfers von Gruppe A (Durchschnittsalter 35,5 ± 5,0) verglichen mit 1930 Tag-5-Blastozysten-Transfers von Gruppe B (Durchschnittsalter 35,2 ± 4,8), die Implantations-, klinische und angehende Schwangerschaftsrate war wie folgt: 38,5 %, 48,9 % und 40 % vs. 49 %, 59,7 % und 51,5 %. Wie Tab. 9 zeigt, waren die Schwangerschaftsraten von vitrifizierten und erwärmten Tag-5-Blastozysten in Gruppe B signifikant besser als mit vitrifizierten und erwärmten Tag-5-Blastozysten in Gruppe A.
Tab. 9
Retrospektive Vergleichsdaten von vitrifizierten und erwärmten Blastozysten entsprechend ihrem Entwicklungsstadium (Tag 5, Tag 6) ohne künstliches Kollapieren des Blastocoel (Gruppe A) und mit künstlichem Kollapieren des Blastocoel (Gruppe B) unter Anwendung des aseptischen Blastozysten-Vitrifikationsprogramms am Fertility Centers of Illinois, Chicago (2007–2016)
 
Gruppe A
Gruppe B
 
Tag 5
Tag 6
Tag 5
Tag 6
Patientinnenalter (Jahre)
35,5 ± 5,0
36,1 ± 4,8
35,2 ± 4,8
36,4 ± 4,7
Anzahl der Transfers
1622
1143
1930
835
Anzahl der erwärmten Blastozysten
2735
2004
2943
1343
Anzahl der überlebenden Blastozysten (%)
2709 (99,0)
1972 (98,4)
2925 (99,4)
1330 (99,0)
Anzahl der transferierten Blastozysten
2632
1930
2913
1306
Durchschnittliche Anzahl transferierter Blastozysten pro Patientin
1,6
1,7
1,5
1,6
Anzahl der Implantationen (%)
1012 (38,4)a
514 (26,6)aa
1426 (49,0)a
519 (39,7)aa
Anzahl positiver Schwangerschaften pro Transfer (%)
926 (57,1)b
497 (43,5)bb
1370 (71,0)b
525 (62,9)bb
Anzahl klinischer Schwangerschaften pro Transfer (%)
793 (48,9)c
416 (36,4)cc
1153 (59,7)c
423 (50,7)cc
Fortlaufende Schwangerschaften pro Transfer (%)
648 (40,0)d
312 (27,3)dd
994 (51,5)d
347 (41,6)dd
Prozent dargestellt in Klammern. χ2; Tag 5: aP <0,01; b,c,dP <0,001; Tag 6: aaP <0,01; bb,cc,ddP <0,001
Wurden die Daten von vitrifizierten und erwärmten Tag-6-Blastozysten verglichen, wurden folgende Daten zwischen Gruppe A (n = 1143; Durchschnittsalter 36,1 ± 4,8) und Gruppe B (n = 835; Durchschnittsalter 36,4 ± 4,7) in Bezug auf Implantations-, klinische und angehende Schwangerschaftsrate ermittelt: 26,6 %, 36,4 %, 27,3 % vs. 39,7 %, 50,7 % und 41,6 %. Wie Tab. 9 zeigt, waren die Outcome-Daten von vitrifizierten und erwärmten Tag-6-Blastozysten in Gruppe B signifikant besser im Vergleich zu vitrifizierten und erwärmten Tag-6-Blastozysten in Gruppe A.

Zusammenfassung

Die hier in diesem Kapitel vorgestellten Daten demonstrieren deutlich, dass die Vitrifikationsmethode eine vielversprechende und zukunftsträchtige Alternative zu den langsamen Einfrierprotokollen darstellt. Heute hat die Vitrifikation die traditionell langsamen Einfrierprotokolle in ihrer Anwendung weitgehend verdrängt. Zwischenzeitlich sind die meisten Embryologen davon überzeugt, dass ein Wechsel von traditionell langsamen zu Vitrifikationsprotokollen nicht nur sinnvoll, sondern notwendig ist. In den meisten IVF-Labors weltweit hat sich die Vitrifikation klinisch etabliert. Dies basiert auf den vielen Vorteilen, die die Vitrifikation mit sich bringt, aber besonders auf einen stetig wachsenden klinischen „Track record“, der mehr und mehr gleichbleibend gute Outcome-Daten liefert.
Hinsichtlich der Vitrifikation von Blastozysten liegt der Schlüssel zum Erfolg in einem optimalen Timing der Embryokryokonservierung. Blastozysten können z. B. individuell dann vitrifiziert werden, wenn sie ein optimales Stadium der Entwicklung und Expansion erreicht haben. Die sich wiederholende Diskussion über die Anwendung von offenen Trägersystemen und die mögliche Gefahr der Kontamination der Zelle mit Bakterien, Pilzen oder verschiedenen Virustypen in LN2 (Tedder et al. 1995; Fountain et al. 1997; Bielanski et al. 2000, 2003; Letur-Könirsch et al. 2003) kann durch den Einsatz eines geschlossenen Trägersystems gänzlich verhindert werden, ohne dass bereits erbrachte gute Outcome-Daten mit einem offenen System kompromittiert werden würden.
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