Polkörper- und Präimplantationsdiagnostik

Genetischen Erkrankungen liegen Mutationen auf Genebene zugrunde. Diese Mutationen äußern sich in einer Veränderung des genetischen Codes eines betreffenden Gens und können manchmal nur einige wenige DNA-Basen betreffen, manchmal aber auch ganze Genduplikationen. Für die PID sind im Wesentlichen die Vererbungsmechanismen der autosomal-rezessiven, autosomal-dominanten und X-chromosomal gekoppelten oder geschlechtschromosomenspezifischen Erkrankungen relevant.

Die Anwendung der PGD wird aber auch für bestimmte familiäre Krebserkrankungen wie z. B. Brustkrebs oder Darmkrebs diskutiert (Konstantopoulou et al. 2009; Spits et al. 2007).

Die geschlechtschromosomenspezifische Diagnostik ist im internationalen Sprachgebrauch als „sexing“ bekannt, da letztlich der Embryo in Hinblick auf geschlechtsspezifische Merkmale untersucht und ausgewählt wird. Dabei wird unterschieden zwischen dem medizinisch indizierten Sexing und dem Sexing aus nicht medizinischen Gründen (Ogilvie und Scriven 2010). Dem medizinisch indizierten Sexing liegen geschlechtschromosomengebundene Erkrankungen zugrunde. Diese werden durch Mutationen in X-chromosomal verankerten Genen verursacht, sodass die Prävalenz der Erkrankungen insbesondere bei Männern sehr hoch ist. Zu den am häufigsten untersuchten Erkrankungen zählen die Duchenne-Muskeldystrophie, die Hämophilie A und das Fragile-X-Syndrom.

Sexing für nicht medizinische Indikationen wird auch als „social sexing“ oder „gender balancing“ bezeichnet und geht mit dem Wunsch der Eltern nach einem Kind mit einem bestimmten Geschlecht einher.

Paare, bei denen einer der Partner eine strukturelle Chromosomenaberration aufweist, haben im Fall einer Schwangerschaft ein hohes Abortrisiko (Sugiura-Ogasawara et al. 2004; Otani et al. 2006).

Zu den strukturellen Chromosomenaberrationen gehören neben den Inversionen oder Duplikationen von Chromosomenabschnitten im Wesentlichen die Translokationen. Man unterscheidet die reziproken und die Robertson-Translokationen. Bei einer reziproken Translokation liegt ein Austausch von distalen Chromosomenabschnitten zwischen nicht homologen Chromosomen vor. Ein solcher Austausch kann sowohl zwei lange, zwei kurze oder einen langen und einen kurzen Chromosomenarm betreffen.

Bei einer Robertson-Translokation liegt eine Fusion von 2 Chromosomen unter Verlust der kurzen Arme vor. Dieser Translokationstyp ist i. d. R. auf die akrozentrischen Chromosomen begrenzt, welche in den kurzen Armen keine genetisch relevante DNA enthalten. Der Träger einer Robertsons-Translokation hat einen um 1 Chromosom verminderten Chromosomensatz. Da sowohl bei einer reziproken als auch bei einer Robertson-Translokation die gesamte lebensnotwendige genetische Information erhalten ist und lediglich die Anordnung auf den Chromosomen eine Veränderung aufweist, spricht man auch von einer balancierten Translokation.

Träger einer balancierten Translokation unterscheiden sich phänotypisch nicht von Menschen mit strukturell völlig unauffälligen Chromosomen, bei denen keine Translokation vorliegt. Während der Bildung der männlichen und weiblichen Keimzellen kommt es jedoch aufgrund der strukturell veränderten Chromosomen im Rahmen der Paarung und anschließenden Trennung der homologen Chromosomen zu einer Fehlverteilung. Das Ausmaß dieser Störung ist von der Größe der translozierten Chromosomenabschnitte abhängig. Die entstehenden Gameten können unter statistischer Betrachtung zu 25 % chromosomal normal sein, zu 25 % tragen sie eine balancierte Translokation, und zu 50 % sind sie unbalanciert. Unter einer unbalancierten Translokation versteht man eine ungleiche Weitergabe der an der Translokation beteiligten Chromosomenabschnitte, sodass partielle Trisomien oder Monosomien entstehen können, die i. d. R. zu einem Abort führen oder zu einem schwer behinderten Kind.

Im Rahmen der PID kann festgestellt werden, ob eine Eizelle oder ein Embryo bezüglich der an der Translokation beteiligten Chromosomen unbalanciert oder balanciert, also unauffällig ist. Eine Unterscheidung zwischen einer balancierten und einer normalen Weitergabe der an der Translokation beteiligten Chromosomen ist mit den üblicherweise verwendeten Sonden i. d. R. nicht möglich. Eine unbalancierte Weitergabe der Translokationschromosomen führt, wie erwähnt, zu partiellen Trisomien oder Monosomien, die mit geeigneten Sonden detektiert werden können. In der Realität findet sich jedoch auch unabhängig von Vorhersagemodellen (Jalbert et al. 1980; Midro et al. 1992; Gardner und Sutherland 2004) sehr oft eine völlig andere Aufteilung der entstehenden Gameten, was im weiteren Verlauf noch diskutiert wird (Abschn. 6.2).

In sehr seltenen Fällen wurden Translokationen unter Beteiligung von mehr als 2 Chromosomen beschrieben. Hierbei ist die Wahrscheinlichkeit, dass balancierte oder „normale“ Gameten entstehen äußerst gering.

Als häufigste Indikation zur Durchführung einer PID sind numerische Chromosomenfehlverteilungen, sog. Aneuploidien, zu nennen. Aneuploidien äußern sich in einem nicht korrekten numerischen Chromosomensatz, d. h. dass eines oder mehrere Chromosomen zu viel (Trisomie) oder zu wenig (Monosomie) vorliegen.

Aneuploidien können sowohl in der Meiose, während der Bildung der Keimzellen, entstehen oder aber postmeiotisch, nach der Verschmelzung der Gameten in dem dann vorliegenden Embryo. Die meisten Aneuploidien entstehen während der Meiose und zu unterschiedlichen Anteilen bei dem Mann und bei der Frau (Nicolaidis und Petersen 1998). Beim Mann wird die Meiose erst ab Beginn der Pubertät initiiert, und erst ab diesem Zeitpunkt werden aus den Stammzellen und entsprechenden Vorläuferzellen in den Hoden Spermien produziert. Bei der Frau wird der Eizellpool bereits im weiblichen Fetus angelegt, und die maximale Anzahl primordialer Follikel ist im 6.–7. Monat gegeben. Dabei sind die Eizellen in einem frühen Stadium der Meiose arretiert und somit bis zu ihrer Rekrutierung und der Fortsetzung der Follikelreifung ab der Pubertät Umwelteinflüssen ausgesetzt. Je länger die Eizellen bis zur Rekrutierung im Eierstock verharren, umso stärker steigt mit dem zunehmenden mütterlichen Alter die Aneuploidierate – bis zu 80 % bei Frauen über 40 Jahre (Hassold et al. 1987; Geraedts et al. 2011). Folglich sind bei Eizellen bedeutend höhere Aneuploidieraten nachweisbar als bei Spermien.

In der Meiose wird der doppelte Chromosomensatz des Spermiums bzw. der Eizelle in 2 Reifeteilungen auf einen haploiden Chromatidensatz reduziert. Beim Mann entstehen aus einer diploiden Vorläuferzelle letztlich 4 haploide Spermien. Bei der Frau entstehen hingegen eine Eizelle und 2 Polkörper, von denen der erste einen Satz an Chromosomenbivalenten enthält, der zweite hingegen einen Chromatidensatz. Entsprechend können Ungleichmäßigkeiten bei der Verteilung der Chromosomen bzw. der Chromatiden durch die Analyse des 1. und 2. Polkörpers detektiert werden.

Entsteht in der Eizelle eine Aneuploidie nach Abschluss der Meiose, dann kann diese mittels Untersuchung von Blastomeren oder Trophektodermzellen nachgewiesen werden. Gleiches gilt für Aneuploidien, die durch ein Spermium verursacht werden. Eine erhöhte Prävalenz für spermienbedingte Aneuploidien wurde für Patienten mit Klinefelter-Syndrom (Staessen et al. 2003) und für Patienten mit extrem stark eingeschränktem Spermiogramm beschrieben (Magli et al. 2009).

Im Fall des Vorliegens einer Aneuploidie kann dies zu einem erhöhten Abortrisiko führen. So ist z. B. eine der häufigsten bekannten Abortursachen das Vorliegen einer fetalen Trisomie 16. Zu den weiteren, häufig zu beobachteten Aneuploidien in Aborten gehören die Trisomien 13, 18, 21 und 22. Andere Chromosomen werden bedeutend seltener im Abortmaterial nachgewiesen, sodass vermutet wurde, dass diese möglicherweise eine erfolgreiche Einnistung eines betroffenen Embryos verhindern und somit eine Schwangerschaft erst gar nicht eintritt (Munné et al. 2004). Aufgrund dieser Betrachtungen wurde im Rahmen der Kinderwunschbehandlung das Aneuploidie-Screening als eine Möglichkeit zur Steigerung der Schwangerschaftsrate angesehen, da nicht implantationskompetente Embryonen frühzeitig detektiert werden und somit die weitere Kultivierung bzw. der Transfer entfallen (Munné et al. 2012).

Die Entnahme von Blastomeren erfolgt i. d. R. im 6- bis 8-Zell-Stadium. Hierzu ist eine Eröffnung der Zona pellucida nötig, um mittels einer Biopsiekapillare Zugang zum perivitellinen Raum zu erhalten. Bei der Entnahme ermöglichen nur Blastomeren mit deutlich erkennbarem Zellkern eine eindeutige Entnahme der DNA. Das Vorhandensein eines Zellkerns ist insbesondere für anschließende FISH-Untersuchungen von größter Bedeutung. Entsprechend ist auf die Anzahl der Zellkerne zu achten, denn das Vorliegen von mehreren Zellkernen in einer Blastomere kann bereits auf eine Aneuploidie hinweisen (Kligman et al. 1996; Hardarson et al. 2001), würde aber im Zusammenhang mit einer monogenetischen Diagnostik die Interpretation der Ergebnisse möglicherweise erschweren.

Für die Durchführung einer Blastomerenbiopsie muss zunächst die Zona pellucida an einer geeigneten Stelle eröffnet werden. Hierzu stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Die Erzeugung der zur Entnahme benötigten Öffnung in der Zona erfolgte anfänglich mit saurer Tyrode-Lösung (Hardy et al. 1990; Kap. „Assisted Hatching“). Die Möglichkeit einer effektiven Blastomerenbiopsie in Verbindung mit einem Lasersystem wurde erstmals 1998 beschrieben (Boada et al. 1998). Eine vergleichende Studie aus der Brüsseler Arbeitsgruppe belegte dann für die Blastomerenbiopsie vielfältige Vorteile der Lasertechnik gegenüber dem Verfahren mit saurer Tyrode-Lösung (Joris et al. 2003). Nach den Daten des ESHRE PGD Consortium ist bereits seit einigen Jahren die laserassistierte Biopsie die am häufigsten eingesetzte Methode im Rahmen der Blastomerenbiopsie (Harper et al. 2010).

Bei der Biopsie wird die Blastomere nicht in die Kapillare eingesogen, vielmehr wird sie aus dem Zellverbund herausgelöst und vorsichtig aus dem perivitellinen Raum entfernt. Das Verfahren ist detailliert in Abb. 1 dargestellt.

Historisch betrachtet wurden die Vorteile der Blastomerenbiopsie darin gesehen, dass die Analyse einer Blastomere einen direkten Hinweis auf die genetische bzw. auf die chromosomale Konstitution des korrespondierenden Embryos gibt und somit väterliche und mütterliche Anteile untersucht werden. Insbesondere bei der Diagnostik von genetischen Erkrankungen (PGD) konnte nach der Entnahme von 2 Blastomeren im 8-Zell-Stadium an beiden Zellen unabhängig voneinander eine genetische Diagnostik durchgeführt werden. Aber auch für die Aneuploidiediagnostik wurde die Entnahme von 2 Blastomeren sehr lange favorisiert. Der direkte Vergleich der Ergebnisse beider Blastomere wurde als einer der wesentlichsten Bestandteile der diagnostischen Sicherheit angesehen.

Für die Unbedenklichkeit der Entnahme von bis zu 2 Blastomeren eines Embryos im 8-Zell-Stadium werden verschiedene Untersuchungen aus den Anfangszeiten der PID angeführt (Nijs und Van Steirteghem 1987; Hardy et al. 1990; Wilton und Trounson 1989). Bereits in früheren Jahren wurden allerdings im Mausmodell dargelegt, dass nach einer Blastomerenbiopsie mögliche Beeinträchtigungen der Schwangerschaftsrate (Van Blerk et al. 1991), der Implantationsrate (Wilton und Trounson 1989) und der fetalen Entwicklung (Krzyminska et al. 1990) auftreten. Die Relevanz dieser Ergebnisse für die Biopsie menschlicher Embryonen zeigte sich nach Studien, bei denen die Zahl der entnommenen Blastomeren mit den Behandlungsergebnissen korreliert wurde. Bei Entnahme von 2 Blastomeren wurden im Vergleich zu der Entnahme nur 1 Blastomere Beeinträchtigungen des embryonalen Entwicklungs- und Implantationspotenzials festgestellt (Cohen et al. 2007; Goossens et al. 2008).

Vor dem Hintergrund der seit 2007 veröffentlichten randomisierten und kontrollierten Studien zum potenziellen Vorteil des Aneuploidiescreenings (PGS; s. auch Abschn. 6.3) wird diskutiert, dass die negativen Ergebnisse u. a. auf dem Verfahren der Blastomerenbiopsie und der damit verbundenen Beeinträchtigung der Embryonalentwicklung beruhen und letztlich zu einem reduzierten Implantationspotenzial führen.

Neuere Untersuchungen belegen mit Hilfe von Zeitrafferaufnahmen, dass nach der Entnahme bereits nur einer Blastomere im 8-Zell-Stadium die betroffenen Embryonen im weiteren Verlauf ihrer In-vitro-Entwicklung eine Wachstumsretardierung zeigen. Diese beruht im Wesentlichen auf einem deutlich verlängerten Zellzyklus des Stadiums, in dem die Biopsie stattfand. Auch zeigen die sich später entwickelnden Blastozysten ein charakteristisch verändertes Schlüpfverhalten beim Verlassen der Zona pellucida (Kirkegaard et al. 2011).

In Hinblick auf die PGD wird die Blastomerenbiospie derzeit nach wie vor an einigen Zentren eingesetzt, während mehrheitlich ein Übergang zu der Blastozystenbiopsie erfolgt ist.

Der 1. und der 2. Polkörper (PK) entstehen im Rahmen der meiotischen Reifeteilung und haben für die weitere Entwicklung der Eizelle bzw. des Embryos keine Bedeutung. Zwar kann der 2. Polkörper und insbesondere dessen Lokalisation ein Indikator für bestimmte Symmetrien bezüglich des entstehenden Embryos sein, doch wird die jeweilige Symmetrieachse nicht durch den 2. Polkörper aktiv induziert.

Der 1. Polkörper kennzeichnet die reife Metaphase-II-Eizelle und enthält einen kompletten Chromosomensatz, in dem jedes Chromosom in Form von gepaarten Chromatiden vorliegt. Direkt nach der Bildung ist der 1. PK mit einer Spindelbrücke an die Eizelle fixiert (Abb. 2; Montag et al. 2006). Erst nach Auflösen dieser Verbindung liegt eine befruchtungsfähige Metaphase-II-Eizelle vor.

Durch das Eindringen des Spermiums wird der Metaphase-II-Arrest der Eizelle aufgehoben, und nach der Trennung der in der Metaphaseplatte lokalisierten gepaarten Chromatiden wird ca. 2–4 h später im 2. PK ein Chromatidensatz ausgeschleust (Abb. 3). Der 2. PK ist somit das erste morphologische Indiz für eine Aktivierung der Eizelle.

Ebenso wie bei dem 1. PK können direkt nach dem Ausschleusen des 2. PK mit geeigneten mikroskopischen Verfahren innerhalb des Zytoplasmastrangs, der den 2. PK mit der Eizelle verbindet, Spindelfasern nachgewiesen werden (Montag et al. 2010a). Diese sind Reste der sich auflösenden Spindel, die zur Trennung der gepaarten Chromatiden während der zweiten meiotischen Reifeteilung nötig sind. Solange diese Spindelfasern persistieren, darf der 2. PK unter keinen Umständen biopsiert werden, da ein hohes Risiko besteht, dass Chromatiden der Eizelle an die Spindelfasern anhaften und aus dieser herausgezogen werden. Dies hätte eine künstlich herbeigeführte Aneuploidie zur Folge.

In der Regel ist eine Biopsie des 2. PK frühestens 5–6 h nach dessen Bildung möglich, während der 1. PK frei im perivitellinen Spalt vorliegt. Der Entnahmezeitpunkt scheint für eine nachfolgende Untersuchung mittels der FISH-Technik von untergeordneter Bedeutung zu sein. Neuere Untersuchungen zeigen jedoch für die Array-CGH, dass, wenn der 2. PK zu früh entnommen wird (<6 h nach ICSI), die Amplifikationseffizienz in der nachfolgenden PCR-Reaktion bedeutend schlechter ist als bei einer Entnahme >6 h nach ICSI (Magli et al. 2011).

Die Biopsie des 1. und 2. PK kann simultan, also zur selben Zeit erfolgen, oder sequenziell, d. h. der 1. PK und der 2. PK werden zu unterschiedlichen Zeiten entnommen. Generell weisen Eizellen bis ca. 2 h nach der Befruchtung eine sehr empfindliche Oolemma auf. Erst mit der abgeschlossenen Kortikalreaktion geht eine Stabilisierung der Oolemma einher, und somit werden jegliche Manipulationen ab 2 h nach Befruchtung von der Eizelle besser toleriert.

Zur Entnahme der Polkörper muss die Zona pellucida eröffnet werden. Dies kann entweder mechanisch (Cieslak et al. 1999) oder mit Hilfe eines Diodenlasers (Montag et al. 1998) erfolgen. Die von der Blastomerenbiopsie und vom „assisted hatching“ bekannte Methode der sauren Tyrode-Lösung kann bei Eizellen nicht eingesetzt werden, da Eizellen gegenüber dem niedrigen pH Wert sehr empfindlich sind und die weitere Entwicklungskompetenz stark eingeschränkt wird. Die mechanische Eröffnung bedarf einer gewissen Erfahrung in der Anwendung. Die laserassistierte Biopsie ist in Abb. 4 dargestellt.

Besondere Aufmerksamkeit muss jedoch fragmentierten Polkörpern entgegengebracht werden. Da jedes Fragment eines oder mehrere Chromosomen bzw. Chromatiden enthalten kann, müssen immer alle Fragmente zusammen entfernt und einer Diagnostik zugeführt werden.

In Hinblick auf die Diagnostik genetischer Erkrankungen mittels der PKD müssen auch aus ethischer Sicht einige Einschränkungen beachtet werden. Zum Einen müssen immer beide Polkörper untersucht werden, da ansonsten ein hohes Risiko für eine Fehldiagnose besteht. Zum anderen muss beachtet werden, dass mit Hilfe der PKD nur eine Aussage für die untersuchte Eizelle, nicht aber für den potenziellen Embryo möglich ist. Wird die Eizelle bei einem autosomal-rezessiven Erbgang als „gesund“ diagnostiziert, so kann das Kind mit einem betroffenen väterlichen Allel wieder Träger einer Erkrankung sein. Wird hingegen die Eizelle als Träger des veränderten Gens identifiziert, so kann das gesunde Allel des Vaters einen Embryo entstehen lassen, der selbst wieder Träger, aber nicht von der Krankheit betroffen ist. Da die als Träger identifizierte Eizelle i. d. R. verworfen wird, unterliegt die PKD hier einem ethischen Dilemma, da die Hälfte der gezeugten Kinder zwar Träger der Erkrankung, aber selbst gesund sind.

Die Blastozystenbiopsie wurde bereits 1997 propagiert (Veiga et al. 1997). Die Methode wird allerdings erst in den letzten Jahren als Alternative zu der als problematisch angesehenen Blastomerenbiopsie zunehmend eingesetzt.

Die Blastozystenbiopsie beinhaltet die Entnahme von Zellen des Trophektoderms am Tag 5 nach der Insemination und erlaubt ebenfalls einen umfassenden Rückschluss auf väterliche und mütterliche chromosomale bzw. genetische Anteile des Embryos. Trophektodermzellen sind an der Bildung der Plazenta beteiligt, während der spätere Fetus sich aus den Zellen der inneren Zellmasse entwickelt. Insofern wird bei einer Blastozystenbiopsie kein embryonales Gewebe entnommen bzw. untersucht.

Die Entnahme erfolgt über eine Öffnung in der Zona pellucida, die oftmals bereits am Tag 3 oder 4 erzeugt wird. Mit zunehmender Entwicklung des Blastozoels dehnt sich die Blastozyste aus und nutzt die vorhandene Öffnung in der Zona zum Schlüpfen (Kap. „Assisted Hatching“). Das Austreten von Zellen im Zuge des Hatching-Prozesses wird auch als „Herniation“ bezeichnet.

Die aus der Hülle ausgetretenen Zellen des Trophektoderms können mit einer Biopsiekapillare entnommen werden (Abb. 5). Dazu werden diese partiell in die Biopsiekapillare eingesaugt, und die Kapillare wird von der an einer Haltekapillare fixierten Blastozyste weggezogen. Der entstehende Verbindungsstrang wird unter Zuhilfenahme eines Lasersystems perforiert, sodass die Zellen von dem Gewebeverband abgetrennt werden können.

Danach stehen diese Zellen für zytogenetische (FISH) oder für molekulargenetische Untersuchungen (PGD, Array-CGH, NGS) zur Verfügung. Bei FISH-Untersuchungen wird jede Zelle einzeln ausgewertet. Die Ergebnisse können durch die Untersuchung mehrerer Zellen besser abgesichert werden. Bei den molekulargenetischen Methoden wird von allen entnommenen Trophektodermzellen die DNA insgesamt isoliert, und somit ist die Effizienz der DNA-Amplifikation sehr hoch. Dies ist insbesondere für PCR-basierte Nachweismethoden (NGS, Array-CGH, PCR für genetische Erkrankungen) von großer Bedeutung. Allerdings ist dadurch nur eine Gesamtaussage für das Amplifikat aller Zellen und nicht für die einzelnen Zellen möglich.

Ein intensiv diskutiertes Thema ist die hohe Mosaikrate, die an Embryonen in frühen Teilungsstadien (8-Zell-Stadium) mittels der FISH-Technik nachgewiesen wurde (Harper et al. 1995). Es war lange Zeit unbklar, ob auch bei der Blastozyste Mosaike vorliegen können und ob und in welchem Ausmaß Zellen des Trophektoderms bzw. der inneren Zellmasse betroffen sind. Theoretisch bestünde die Möglichkeit, dass bei mehreren Trophektodermzellen mit einer Mosaiksituation für ein bestimmtes Chromosom sowohl Zellen mit einer Monosomie als auch einer Trisomie vorliegen. Da bei der Trophektodermbiopsie wie bereits erwähnt die amplifizierte DNA von mehreren Zellen untersucht wird, kann dies bei Vorliegen eines Mosaiks im ungünstigsten Fall dazu führen, dass dies mit der Array-CGH nicht erkannt wird, da im Mittel kein Zuviel oder Zuwenig an DNA für das betreffende Chromosom vorliegt. Mit der höheren Auflösung des NGS-Verfahrens konnte inzwischen eindeutig gezeigt werden, dass verschiedengradige Mosaike in Biopsien von Trophektodermzellen nachweisbar sind und dass nach Transfer von Embryonen mit nachgewiesenem Mosaik in Trophektodermzellen gesunde Kinder zur Welt kommen können (Greco et al. 2015). Die momentane Diskussion geht in die Richtung, dass eventuell laborspezifische Einflüsse den Mosaikgrad bestimmen können, was die Zuverlässigkeit der Blastozystenbiopsie an sich in Frage stellt (Sachdev et al. 2016; Munné et al. 2017a).

Ein weiterer Nachteil der Blastozystenbiopsie besteht darin, dass der Zeitpunkt der Biopsie abhängig von der fortschreitenden Ausstülpung von trophektodermalen Zellen aus der Zonaöffnung ist (McArthur et al. 2005).

Die Entnahme von Trophektodermzellen von einer Blastozyste ohne Herniation ist sehr schwierig und nicht immer möglich. Insofern dürfte die Blastozystenbiopsie trotz der Tatsache, dass im Vergleich zur Blastomerenbiopsie weniger Embryonen letztlich biopsiert werden, zeitaufwendiger sein. Diese Methode setzt in jedem Fall eine entsprechend hohe Erfahrung im Umgang mit Mikromanipulatoren voraus.

Die FISH-Technik (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) wurde sehr früh für die Aneuploidiediagnostik eingesetzt. Sie beruht auf der Markierung von chromosomenspezifischen Sonden mit jeweils einem definierten Fluoreszenzfarbstoff. In der Routineanwendung können dabei 5–6 verschiedene Sonden in Kombination für eine Hybridisierung auf die biopsierten und fixierten Zellen (Polkörper, Blastomere, Trophektodermzellen) eingesetzt werden.

Die Auswertung erfolgt mit einem Fluoreszenzmikroskop und geeigneten Fluoreszenzfiltern. Jedes Farbsignal zeigt das Vorhandensein des jeweiligen Chromosoms oder Chromosomenabschnitts an. Insofern ermöglicht die FISH-Technik die Erfassung der Anzahl von ganzen Chromosomen oder Chromatiden sowie die gezielte Analyse der Geschlechtschromosomen, z. B. im Rahmen des „social sexing“ (Abschn. 2.1). Hierzu werden sowohl locusspezifische als auch zentromerspezifische Sonden eingesetzt, die kommerziell erhältlich sind.

Durch die Möglichkeit, bestimmte Chromosomenabschnitte zu untersuchen, eignet sich die FISH-Technik auch für die Diagnostik von strukturellen Chromosomenaberrationen. Bei Translokationen werden i. d. R. Kombinationen von telomer- und zentromerspezifischen Sonden verwendet. Nachteile der FISH-Technik für den Routineeinsatz sind die Begrenzung auf eine geringe Anzahl von Fluoreszenzfarben und die eingeschränkte Verfügbarkeit von markierten Chromosomensonden.

Unter optimalen Bedingungen können 2–3 Hybridisierungsrunden mit unterschiedlichen Chromosomensonden durchgeführt werden, was die Analyse von 12–15 Chromosomen ermöglicht (Abdelhady et al. 2003; Munné et al. 1998, 1999; Munné 2010). Da jedoch die Hybridisierungseffizienz nach jeder Rehybridisierung deutlich geringer wird, ist eine zuverlässige Auswertung erschwert (Ruangvutilert et al. 2000; Munné et al. 2012).

Die Einschränkungen der FISH-Technik in Hinblick auf die Anzahl der zu untersuchenden Chromosomen wurde durch die sog. CGH aufgehoben. Eine wesentliche Voraussetzung für die Durchführung der CGH ist eine ausreichende Menge an DNA, die durch eine Amplifikation der ursprünglich in einer Zelle (Polkörper, Blastomere) oder in einigen wenigen Zellen (Trophektoderm) vorhandenen DNA gewonnen wird.

Das Prinzip der CGH ist, dass eine Test-DNA mit einem definierten Fluoreszenzfarbstoff markiert wird und mit einer in einer anderen Farbe markierten Kontroll-DNA gegen alle Chromosomen hybridisiert wird. Wenn diese Chromosomen wie bei einem Kariogramm als Metaphasechromosomen auf einem Objektträger aufgetragen sind, spricht man von einer m-CGH, wenn sie jedoch in Form von chromosomenspezifischen Bac-Klonen in einem charakteristischen gitternetzähnlichen Muster auf einem Objektträger aufgetragen sind, spricht man von einer Array-CGH (Abb. 6).

Unterschiede in der Häufigkeit ganzer Chromosomen oder Chromosomenabschnitte können durch eine Farbverschiebung in der Analyse erkannt werden (Abb. 7). Wenn beispielsweise in der zu testenden Zelle im Rahmen einer Trisomie ein Chromosom zu viel vorliegt, dann ist für dieses Chromosom mehr markierte DNA vorhanden, und die zur Markierung verwendete Farbe überwiegt in der Analyse.

Diese Methode wurde ursprünglich für die onkologische Diagnostik entwickelt (Albertson et al. 2000) und mit Modifikationen bereits sehr früh in experimentellen Studien im Rahmen des „preimplantation genetic screening“ (PGS) für die Aneuploidiediagnostik an Blastomeren (Voullaire et al. 2000; Wilton et al. 2003) und an Polkörpern (Wells und Delhanty 2000) eingesetzt. Die ursprüngliche m-CGH-Methode war sehr zeitaufwendig, und obwohl die anfänglichen Arbeitszeiten von 72 h auf 18 h verkürzt werden konnten (Landwehr et al. 2008), war die m-CGH-Methode in der Routine nicht praktikabel, da die Auswertung für jeden Polkörper jeweils 1 h in Anspruch nimmt.

Erst die Einführung der Array-CGH ermöglichte eine zuverlässige und zeitnahe Analyse aller Chromosomen (Le Caignec et al. 2006).

Die PCR wird insbesondere für die Diagnostik von monogenetischen Erkrankungen eingesetzt. Das Grundprinzip besteht darin, die veränderten genetischen Abschnitte der DNA mit geeigneten PCR-basierten Nachweismethoden darzustellen und die normale (gesunde) Variante von der veränderten (krankmachenden) zu unterscheiden. Dies kann durch einen Größenvergleich oder durch eine direkte Sequenzanalyse der erhaltenen DNA-Abschnitte erfolgen. Bei der PCR werden zunächst geeignete Sonden, sog. Primer benutzt, die für die betreffenden Genregionen spezifisch sind. Mit Hilfe dieser Primer erfolgt eine Amplifikation der Ausgangs-DNA aus den Einzelzellen.

Ein Problem der Einzelzell-PCR ist der sog. „allel dropout“ (ADO), d. h. dass eines der zwei vorhandenen Allele eine präferenzielle Amplifikation zeigt und das andere Allel nicht amplifiziert. Dies beinhaltet die Gefahr von falsch-positiven wie auch falsch-negativen Diagnosen und kann nur durch geeignete Marker, die an das zu untersuchende Gen gekoppelt sind, ausgeschlossen werden. Mittels der sog. Multiplex-PCR können die meisten technischen Probleme der Einzelzell-PCR sowie Kontaminationen erfasst werden (Sermon 2010).

Next Generation Sequencing ermöglicht einen hohen Durchsatz an Sequenzanalysen. Der Begriff umfasst jedoch mehrere verschiedene Sequenzierungstechnologien, welche sich je nach verwendeter Plattform unterscheiden. Allen gemeinsam ist der Ansatz des parallelen, massiven Sequenzierens von amplifizierten DNA-Fragmenten, welche mit Barcodes versehen sind, um eine eindeutige Zuordnung zu der Herkunft der zur Amplifikation eingesetzten DNA (im Fall von PGS/PGD: Eizelle/Embryo) zu ermöglichen. Der hohe Probendurchsatz wird durch weitgehende Automatisierung und den Einsatz von Informations-Softwarelösungen ermöglicht.

Mit NGS sind sowohl strukturelle als auch numerische Chromosomen-Fehlverteilungen detektierbar. Parallel können auch gezielt spezifische Gensequenzen von bekannten Erkrankungen oder Prädispositionen untersucht werden.

Im Rahmen des ESHRE PGD Consortiums werden jährlich die Daten aller Mitgliedszentren erhoben, kontinuierlich ausgewertet und jährlich veröffentlicht. Da im ESHRE PGD Consortium im Wesentlichen europäische und nur einige wenige amerikanische/asiatische Zentren vertreten sind, kann diese Datensammlung nur ein orientierendes Bild geben. Generell ist bei der Auswertung in den letzten Jahren eine deutliche Zunahme des Anteils der genetischen Erkrankungen an allen PID-Zyklen zu beobachten. So wurden in der letzten Erhebung allein für das Jahr 2007 insgesamt 2042 Behandlungszyklen für genetische Erkrankungen dokumentiert gegenüber 8111 für den gesamten Zeitraum davor von 1999–2006 (Harper et al. 2010).

Die häufigsten Indikationen für autosomal-rezessive Erkrankungen waren die β-Thalassämie, die zystische Fibrose und die spinale Muskelatrophie. Bei den autosomal-dominanten Erkrankungen lag die Chorea Huntington vor der myotonen Dystrophie Typ I, der Neurofibromatose und dem Charcot-Marie-Tooth-Syndrom. Geschlechtschromosomengebundene Erkrankungen waren im Wesentlichen das Fragile-X-Syndrom, die Duchenne- und die Becker-Muskeldystrophie sowie die Hämophilie A und B. In der Regel kann bei ca. 75 % der Punktionszyklen auch ein Embryotransfer durchgeführt werden, und die Chance auf eine Schwangerschaft pro Transfer wird inzwischen mit 31 % (für das Jahr 2007) angegeben, im Vergleich zu 26 % für die gesamten Vorjahre (Harper et al. 2010).

Der Anteil an Zyklen, die mittels PKD bearbeitet wurden, betrug im Jahr 2007 2 % (41 Zyklen). Der Grund für den sehr geringen Anteil an PKD-basierten Zyklen dürfte sicherlich in den bereits diskutierten Begrenzungen der PKD auf das Vorliegen von genetischen Erkrankungen liegen. Der Anteil der Blastozystenbiopsie lag im Jahr 2007 bei 1 % und dürfte sich in den folgenden Datensammlungen positiv verändern, da auch für die genetischen Erkrankungen ein Umdenken und damit verbunden eine Abkehr von der Blastomerenbiopsie zu verzeichnen ist.

Die Prävalenz für eine reziproke bzw. Robertson-Translokation liegt bei 1:500 bzw. 1:1000 Neugeborenen. Zudem findet sich im Rahmen der Kinderwunschbehandlung mit ICSI ein überdurchschnittlich hoher Anteil an Paaren, bei denen der Mann oder die Frau eine Translokation aufweist. Laut den Daten des ESHRE PGD Consortiums ist bei Vorliegen einer Translokation in Verbindung mit einer PID mit FISH die Schwangerschaftsrate bezogen auf einen erfolgten Embryotransfer bei ca. 28–34 % bei reziproken Translokationen und 33–43 % bei Robertson-Translokationen (Harper et al. 2010).

Ein Grundproblem bei der Translokationsdiagnostik ist die geringe Anzahl an normal oder balanciert vorliegenden Embryonen bzw. Gameten. So sind nach Polkörperdiagnostik i. d. R. nur 10 % der entstehenden Eizellen normal oder balanciert; die anderen Eizellen sind bezüglich der an der Translokation beteiligten Chromosomen unbalanciert (Montag et al. 2010b). Nach der Embryobiopsie sind nur ca. 15–40 % der diagnostizierten Embryonen normal oder balanciert (Harper 2010). Es wird zudem diskutiert, dass das Vorliegen einer Translokation den regelrechten Ablauf der Meiose stört und zusätzliche numerische Chromosomenfehlverteilungen auftreten können (Gianaroli et al. 2002; Pujol et al. 2003; Buchholz und Clement-Sengewald 2004). Auch wenn nach der FISH-Untersuchung der an der Translokation beteiligten Eizellen noch eine weitere Hybridisierungsrunde für eine Aneuploidietestung durchgeführt wird, ist die Zahl der untersuchten Chromosomen relativ gering.

Eine erweiterte Diagnostik wurde mit der Einführung der Array-CGH möglich, da diese eine gleichzeitige Überprüfung für strukturell bedingte partielle Aneuploidien der Translokationschromosomen wie auch für Aneuploidien aller übrigen Chromosomen zulässt. Eine erste Übersichtsarbeit belegt bereits 2002, dass Embryonen von Patientinnen mit einer balancierten Translokation eine hohe Mosaikrate gegenüber Chromosomen, die nicht an der Translokation beteiligt sind, aufweisen (Malmgren et al. 2002).

Im Rahmen der ESHRE-Pilotstudie zum Einsatz der Array-CGH bei der PKD wurden auch 3 Paare mit einer nachgewiesenen Translokation bei der Frau untersucht. Dabei konnten neben den translokationsbedingten Aberrationen gleichzeitig numerische Fehlverteilungen aller Chromosomen detektiert werden. Die Ergebnisse zeigten, dass neben den erwarteten partiellen Aneuploidien für die Translokationschromosomen auch Aneuploidien für andere Chromosomen gefunden werden. Bei 2 der 3 Paare wurde ein Transfer durchgeführt, und beide resultierten in einer Schwangerschaft und der Geburt gesunder Kinder (Montag et al. 2010a).

Diese vorläufigen Daten wurden inzwischen von einer größeren Studie aus Italien bestätigt, wo ebenfalls bei Translokationspatienten nach Blastomerenbiopsie und Array-CGH eine auffällig hohe Aneuploidierate für Nichttranslokationschromosomen berichtet wurde (Fiorentino et al. 2011). Aber auch in dieser Studie waren die Schwangerschaftsraten, wenn ein Transfer durchgeführt werden konnte, mit 70 % pro Transfer überdurchschnittlich hoch. In Hinblick auf die eingangs erwähnten vergleichsweise geringen Erfolgsraten, die beim ESHRE PGD Consortium hinterlegt sind, deuten diese Ergebnisse auf Folgendes hin:

Die Hauptindikationen für eine Durchführung des „preimplantation genetic screening“ zur Detektion von numerischen Chromosomenfehlverteilungen sind das Alter der Frau, wiederholte Spontanaborte und wiederholtes Implantationsversagen.

Bis vor kurzem wurde für das PGS mehrheitlich die Biopsie von 1–2 Blastomeren und die FISH-basierte Untersuchung von 5–10 Chromosomen durchgeführt. Die PKD wurde nur im deutschsprachigen Raum und in einigen wenigen internationalen Zentren angeboten (Montag et al. 2010c). Die Datenerhebung des ESHRE PGD Consortiums belegt, dass PGS das am häufigsten durchgeführte Verfahren in den angeschlossenen internationalen Zentren ist. Wurden in der Zeit vor 1997 insgesamt 116 PGS-Zyklen gemeldet, so waren es im Jahr 2007 allein 3750 Zyklen (Harper et al. 2010).

Fast alle frühen Publikationen zu „preimplantation genetic screening“ nach Polkörperbiopsie und nach Blastomerenbiopsie erfolgten auf der Basis von retrospektiven Studien oder in Form von Vergleichsstudien, bei denen gematchte Kollektive als Kontrollgruppe verwendet wurden. Die Mehrzahl dieser Studien untersuchte als primäres Ergebnis die Implantations- und Schwangerschaftsraten und vereinzelt die Abortraten. Geburtenraten wurden i. d. R. nicht dokumentiert. Diese frühen Studien nach Blastomerenbiopsie kamen zu dem Schluss, dass „preimplantation genetic screening“ zu besseren Ergebnissen führt bei:

Auch retrospektive Studien zu „preimplantation genetic screening“ nach Polkörperdiagnostik lieferten ähnliche Ergebnisse (Munné et al. 1995; Verlinsky et al. 1995, 2005; Montag et al. 2004; van der Ven et al. 2008).

Eine systematische Metaanalyse fand für alle Publikationen vor 2004 Probleme im Studiendesign und stellte fest, dass diese Arbeiten für eine systematische Auswertung nicht herangezogen werden können und damit auch die Aussagekraft dieser Arbeiten fraglich ist (Twisk et al. 2006). Eine erste kritische und viel beachtete Arbeit aus dem Jahr 2007 zeigte keinen Vorteil für PGS hinsichtlich der Verbesserung der Behandlungserfolge (Mastenbroek et al. 2007). In kurzer Folge erschien dann eine Vielzahl von randomisierten kontrollierten Studien, die alle keinen Vorteil für das PGS nach Blastomerenbiopsie und FISH belegen konnten (Geraedts et al. 2010).

Auch zur PKD erschien eine deutsche Studie, die für die Studiengruppe eine niedrigere Schwangerschaftsrate berichtete als für die Kontrolle (Haaf et al. 2010). Befürworter des „preimplantation genetic screening“ kritisierten, dass bei einigen der genannten Studien methodische Probleme zugrunde liegen und somit auch diese Studienergebnisse kritisch zu betrachten sind (Cohen und Munné 2004; Cohen und Grifo 2007; Montag und van der Ven 2007; Munné et al. 2007). Eine weitere Erklärung für die teils schlechteren Ergebnisse nach Blastomerenbiopsie wird inzwischen darin gesehen, dass in den frühen Teilungsstadien zu einem hohen Grad Mosaike vorliegen (Harper et al. 1995; Baart et al. 2006), dass die Entnahme von 2 Blastomeren das Entwicklungs- und Implantationspotenzial eines Embryos negativ beeinflusst (Cohen et al. 2007; Goossens et al. 2008) und dass immer nur eine vergleichsweise geringe Anzahl von Chromosomen mit FISH untersucht wurde, aber nie alle Chromosomen (Geraedts et al. 2010).

Als Reaktion auf die Studienergebnisse hatte die ESHRE im Jahr 2008 eine Task Force PGS gegründet, die zu dem Schluss kam, dass die Frage nach einem Vorteil des „preimplantation genetic screening“ bei der Indikation fortgeschrittenes mütterliches Alter nur durch eine kontrollierte randomisierte multizentrische Studie nach Biopsie des 1. und 2. Polkörpers und in Verbindung mit der Untersuchung aller Chromosomen durch Array-CGH beantwortet werden kann (Geraedts et al. 2010). Zur Vorbereitung dieser multizentrischen Studie wurde eine Pilotstudie vorgeschaltet, die 2009–2010 in den Zentren in Bonn und Bologna durchgeführt wurde und deren Ergebnisse die prinzipielle Machbarkeit des geplanten Vorgehens bewiesen (Geraedts et al. 2011; Magli et al. 2011). Die Multicenterstudie startete im Sommer 2012 an 7 europäischen Zentren, und die Ergebnisse der ESTEEM-Studie wurden auf der ESHRE 2017 vorgestellt. In der Studiengruppe mit Polkörperbiopsie und Aneuploidie-Screening mittels Array-CGH wurden die gleichen Schwangerschaftsraten erzielt wie in einer Kontrollgruppe, jedoch lag die Rate an Fehlgeburten in der Studiengruppe deutlich niedriger (Brown 2017).

Mittlerweile wurden auch die Daten einer weiteren randomisierten kontrollierten Studie zum Einsatz des PGS in Verbindung mit Trophektodermbiopsie und NGS-Diagnostik vorgestellt (STAR trial; https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02268786?term=STAR+aneuploidy&rank=1. Zugegriffen am 28.12.2018). Diese Studie wurde an 34 Zentren in 4 Ländern durchgeführt und ergab, dass PGS die weiterführende Schwangerschaftsrate nur bei Frauen im Alter von 35–40 Jahren relativ um 38 erhöhen konnte. Hingegen konnte bei Frauen unter 35 Jahren kein Vorteil durch das Aneuploidie-Screening belegt werden. In Verbindung mit der aktuellen Diskussion zur zentrenspezifischen Variabilität der Aneuploidieraten (Munné et al. 2017a) und dem Eintritt von erfolgreichen Schwangerschaften nach Transfer von Mosaik-Embryonen (Greco et al. 2015; Munné et al. 2017b) ist auch weiterhin eine kritische Auseinandersetzung mit dem Präimplantationsscreening erforderlich.