Antikoagulanzien in vitro
Antikoagulanzien in vitro
Synonym(e)
Gerinnungshemmer
Englischer Begriff
anticoagulants
Definition
Stoffe, die durch ihre Wirkungen die Gerinnung des Blutes verhindern, hemmen oder verzögern (Tab. 1). In vitro werden sie hauptsächlich zur Gerinnungshemmung von Blut bei der Gewinnung von Plasma eingesetzt.
Tab. 1
Konzentrationen und Anwendungsbereiche
Antikoagulans | Konzentration | Buchstaben-Code | Farb-Codes | Anwendungsbereiche |
|---|---|---|---|---|
Salze der Ethylendiamintetraessigsäure In Europa wird K2-EDTA bevorzugt | 1,2–2,0 mg/mL Blut (4,1–6,8 mmol/L Blut), bezogen auf wasserfreies EDTA als Dikalium-, (Trikalium-) oder Dinatriumsalz | K2E (K3E) N2E | Lila, (rot) | Hämatologische Untersuchungen EDTA-Plasma zur Stabilisierung durch Hemmung von Metalloproteinasen (z. B. Proteohormonmessung und in der molekulardiagnostischen Virus diagnostik) |
Citrat Trinatriumcitrat | 0,100–0,136 mol/L Citronensäure Gepuffertes Citrat pH 5,5–5,6: 84 mmol/L Na3-Citrat plus 21 mmol/L Citronensäure 0,109 mol/L (3,2 %) wurde zur Erreichung der Standardisierung empfohlen | 4NC 9NC | Hellblau, (grün) Schwarz, (lila) | Für Gerinnungsuntersuchungen wird eine Mischung von 1 Volumenanteil Citrat mit 9 Volumenanteilen Blut empfohlen; zur Bestimmung der Blutkörperchensenkungsgeschwindigkeit werden 1 Volumenanteil Citrat mit 4 Volumenanteilen Blut gemischt |
Heparinate Natrium-, Lithium- oder Ammoniumsalze von unfraktioniertem Heparin (Molmasse von 3–30 kDa) | 10–30 internationale Einheiten/mL Blut zur Gewinnung von Heparinplasma. Für die Bestimmung von ionisiertem Kalzium wird Kalziumtitriertes Heparin empfohlen in einer Konzentration von 40–60 IU/mL Blut bei Trockenheparinisierung und 8–12 IU/mL Blut bei Flüssigheparinisierung | NH LH | Dunkelgrün (ohne Gel), Hellgrün (mit Gel), (Orange) | Klinisch chemische Untersuchungen, ionisiertes Kalzium |
Hirudin Ein Antithrombin aus Blutegeln, das gentechnisch in reiner Form als Antikoagulans erprobt wird, bindet Thrombin zu einem 1:1-Hirudin-Thrombin-Komplex | 10 mg/L | kein Farb code festgelegt | Alternative für Heparinate, Thrombozytenfunktionsdiagnostik | |
Oxalat/Fluorid-Mischung von K2- oder NH4-Oxalat (FX) mit Na-Fluorid, EDTA(FE), Heparinat (FH) oder Citronensäure (FC) | 2–3 g/L Blut Oxalat mit 2 g/L Fluorid | FX, FE, FH, FC | Grau (FX,FE, FH), (Gelb), Rosa (FC) |
Beschreibung
Wenn eine entnommene Blutprobe nach der Entnahme gerinnt, kann sie in ein solides Gerinnsel und eine flüssige Phase separiert werden. Die flüssige Phase nennt man Serum. Wenn ein Antikoagulans, z. B. Heparin, zugesetzt wird, wird die flüssige Phase als Plasma bezeichnet. Im Vergleich zu Plasma fehlt Serum Fibrinogen und weitere Gerinnungsfaktoren und das Gesamtprotein ist demzufolge ca. 3 g/L niedriger. Während des Gerinnungsprozesses wird Kalium aus Thrombozyten freigesetzt, sodass Kalium im Serum um 0,2–0,3 mmol/L höher als im Plasma ist. Im Plasma ist die Phosphatkonzentration um 2 mg/L niedriger. Heparinisiertes Plasma kann sofort nach der Entnahme separiert werden und eignet sich daher für Notfalluntersuchungen. Heparinisiertes Plasma wird für kardiologische Notfallmarker von der National Academy for Clinical Biochemistry, USA, empfohlen. Nachteilig ist, dass Heparin beispielsweise Thyroxin aus seiner Proteinbindung verdrängen kann und damit falsche Werte liefert. Ebenso eignen sich natürlich heparinisierte Plasmen nicht zur Bestimmung, wenn das entsprechende Kation, dessen Heparinsalz man als Antikoagulans benutzt hat, gemessen werden soll (Lithium, Ammonium).
EDTA komplexiert divalente Kationen (Chelatbildner) und wird als EDTA-Vollblut in der Hämatologie eingesetzt. EDTA inhibiert aber auch Enzyme, die in vitro die Werte für Lipide, Nukleinsäuren oder Peptidhormone verändern können. EDTA-Kontaminationen können zu fehlerhaften Bestimmungen führen, in Gerinnungsproben kann die Gerinnungszeit verlängert und Kaliumkonzentrationen erhöht gemessen werden. EDTA stört kolorimetrische Tests für Calcium und Magnesium und reduziert die Aktivität von Enzymen wie Kreatinkinase oder alkalische Phosphatase (Phosphatase, alkalische). Deshalb sollten EDTA-Röhrchen am Ende einer Blutentnahme befüllt werden.
EDTA-Plasma ist für Gerinnungsmessungen nicht geeignet, da EDTA zu einer raschen Inaktivierung der Gerinnungsfaktoren V und VIII führt und die Fibrinpolymerisation stört. So ist für die Assoziation der schweren und leichten Kette des Faktors VIII die Gegenwart von Kupferionen erforderlich. Werden diese durch EDTA komplexiert, verliert der Gerinnungsfaktor VIII seine Aktivität. Dieser Aktivitätsverlust scheint für Gerinnungsfaktor V reversibel zu sein, für Gerinnungsfaktor VIII jedoch nicht (Bihoreau et al. 1994). Dagegen führt EDTA nicht zu der für Citrat bekannten Erythrozytenschrumpfung (s. unten). EDTA ist deshalb das für hämatologische Untersuchungen präferierte Antikoagulans.
Citratplasma ist für hämatologische Untersuchungen nicht geeignet, da Citrat (im Unterschied zu EDTA) zu einer erheblichen Schrumpfung der Erythrozyten führt. Dennoch ist der Einsatz von Citratplasma sinnvoll, wenn EDTA-induzierte Antikörper zu Pseudothrombozytopenien führen. Dann müssen die Thrombozytenwerte allerdings wegen der Verdünnung des Plasmas durch den Citratzusatz (1 Volumenanteil auf 10) mit dem Faktor 1,111 multipliziert werden, um die für EDTA-Plasma repräsentativen Referenzbereiche anwenden zu können. Wird anstelle von reiner Citratlösung eine ACD-Mischung als Antikoagulans verwendet, tritt der Schrumpfungseffekt nicht auf (Rosenblum 1968). Da Citrat nicht zur Inaktivierung von Gerinnungsfaktoren führt, ist es das für Gerinnungsuntersuchungen zu bevorzugende Antikoagulans.
Gebräuchlich sind sowohl 0,105-molare als auch 0,129-molare Citratlösungen, die in Abhängigkeit von den eingesetzten Testreagenzien zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Unterfüllung des Teströhrchens führt zu fälschlich verlängerten Gerinnungszeiten. Ebenso werden, wenn die vorgelegte Menge an Citratlösung für Proben mit einem Hämatokrit >0,60 L/L nicht korrigiert wird, verlängerte Gerinnungszeiten in den Gruppentests gemessen.
Das optimale Volumen der Citratlösung (S) berechnet sich nach der Formel von Komp und Sparrow:
$$ \mathrm{S}=\frac{\mathrm{V}\bullet \left(1-\mathrm{HK}\right)}{6,4-\mathrm{HK}} $$
V: Volumen der Blutprobe (Blut und Citratanteil); HK: Hämatokrit (SI-Einheiten).
Oxalatplasma ist für hämatologische Untersuchungen wegen der für Citrat beschriebenen Schrumpfung der Erythrozyten nicht geeignet.
Literatur
Bihoreau N et al (1994) Copper-atom identification in the active and inactive forms of plasma-derivided FVIII and recombinant FVIII-delta II. Eur. Biochemist 222:41–48CrossRef
CLSI Document H1-A6 (2010) Tubes and additives for venous and capillary blood specimen collection; approved standard
ISO, EN/DIN 6710 (2004) Gefäße zur einmaligen Verwendung für die venöse Blutabnahme beim Menschen. Berlin: Beuth-Verlag
EN/DIN 14820 (2004) Gefäße zur einmaligen Verwendung für die venöse Blutabnahme beim Menschen. Beuth-Verlag, Berlin
Rosenblum WI (1968) In vitro measurements of the effects of anticoagulants on the flow properties of blood: the relationship of these effects to red cell shrinkage. Blood 31:234–241PubMed