Alkalische Phosphatase (AP) ist eine Familie von nahezu ubiquitär vorkommenden Isoenzymen, die die Hydrolyse einer großen Vielfalt natürlicher und synthetischer Phosphatester bei einem alkalischen pH-Optimum (pH 9–10) hydrolysiert und deren physiologische Funktionen bisher nicht sicher bekannt sind.
Synthese – Verteilung – Abbau – Elimination
Alle Isoenzyme der AP sind Glykoproteine, die divalente Kationen wie Mg2+ und Zn2+ für ihre Aktivität benötigen. Sie sind immunologisch distinkt und haben verschiedene physikochemische Eigenschaften, aber überlappende Substratspezifitäten. AP wird von 4 differenten Genloci auf 2 separaten Chromosomen (Abb. 1) kodiert. Zuständig ist jeweils dasjenige Gen, das
AP-Isoenzyme von Leber, Knochen, Ersttrimesterplazenta und Niere (gewebeunspezifische AP) kodiert,
AP von Dritttrimesterplazenta und Intestinum kodiert,
für eine zweite intestinale AP kodiert,
für die fetale intestinale AP kodiert.
Abb. 1
AP-Kodierung von 4 differenten Genloci auf 2 separaten Chromosomen
×
Neben den durch 4 separate Gene kodierten Isoenzymen treten durch posttranslationale Modifikationen wie partielle Proteolyse, Glykosylierung und Lipidbindungen immunologisch (bis zu 16) distinkte Isoformen und Varianten auf. AP kommt praktisch in allen Geweben und Körperflüssigkeiten (Serum, Urin, Galle, Lymphe) vor, relativ hohe spezifische Aktivitäten finden sich in Leber (Hepatozyten und Gallengangepithelien), Knochen (Osteoblasten), Intestinum (Mikrovilli der intestinalen Mukosa), Plazenta, Niere (proximaler Tubulus) und Leukozyten (Leukozyt). AP ist über einen Glykan-Phosphatidylinositol-(GPI-)Anker an Plasmamembranen (sinusoidale und kanalikuläre Membranbereiche der Leberzellen) gebunden. Eine Inositol-spezifische Phospholipase D kann AP aus dem GPI-Anker freisetzen.
Die im Einzelnen noch unklaren Funktionen werden in folgenden Bereichen vermutet: Kalzifikation des Knochens (Osteoblasten), Regulation der sekretorischen Aktivität des Gallengangepithels der Leber, Regulation der Lipidresorption und des Lipidtransports im Dünndarm (fettreiche Mahlzeiten erhöhen die AP-Aktivität im Blut), Entgiftung von Endotoxin (Lipopolysaccharide der gramnegativen Bakterien) durch Phosphathydrolyse. In der Zirkulation gesunder Probanden ist vorwiegend Leber- und Knochen-AP vorhanden, deren fraktioneller Anteil altersabhängig variiert (Knochen-AP bei Kindern und in der Adoleszenz in Abhängigkeit vom Knochenwachstum erhöht). In der Schwangerschaft ab dritten Monat ist die AP-Aktivität auf etwa das 2- bis 3-Fache des oberen Normbereichs erhöht. Probanden der Blutgruppen B und 0 haben einen relativ hohen Anteil des intestinalen Isoenzyms in der Zirkulation, besonders nach fettreicher Mahlzeit. Die Halbwertszeit der AP in der Zirkulation liegt zwischen 3 und 7 Tagen. Die Isoformen werden unterschiedlich schnell eliminiert, vorwiegend über den Asialoglykoproteinrezeptor der Hepatozyten.
Funktion – Pathophysiologie
Bei cholestatischen (hepatobiliären) Lebererkrankungen benigner und maligner Ursache kommt es über die Retention von Gallensäuren zur Induktion der AP in Hepatozyten und Gallengangepithel, die das Enzym über gelockerte „tight junctions“ nach Spaltung des GPI-Ankers durch Plasmaphospholipasen in die Zirkulation abgeben. Dort kommt es auch als hochmolekularer, an Lipoprotein X gebundener Komplex oder als partikuläres, an Plasmamembran gebundenes Fragment vor (partikuläre Form). Die partikuläre Form könnte Ausdruck eines Membran-Shedding unter dem Einfluss retinierter Gallensäuren (Detergenzien) sein und enthält häufig 5’-Nukleotidase- und γ-Glutamyltransferase-Aktivität. In malignen Geweben kommt es zur Expression weiterer Isoenzyme wie Nagao-, Regan- und Kasahara-Isoenzym (ektopische Synthese durch Tumoren).
Untersuchungsmaterial – Entnahmebedingungen
Serum, Heparin-Plasma (kein EDTA-, Fluorid-, Citrat- und Oxalat-Plasma).
Probenstabilität
Bei Raumtemperatur und 4–8 °C über 7 Tage kein Aktivitätsabfall, bei −20 °C mindestens 2 Monate stabil. Es kann zu lagerungsabhängigen Aktivitätsanstiegen bei Raumtemperatur kommen.
Präanalytik
Patient sollte 12 Stunden nüchtern sein.
Komplexierende Antikoagulanzien (Citrat, Oxalat, EDTA) führen zu starken Aktivitätsverlusten durch Bindung des Cofaktors Mg2+.
Analytik
Für die Aktivitätsbestimmung der AP sind zahlreiche Methoden und deren Modifikationen beschrieben worden. Eine IFCC-Standardmethode ist im Jahr 1983 empfohlen worden (Abb. 2):
In einem 2-Amino-2-Methyl-1-Propanolpuffer (pH 10,4) wird die Aktivität der AP in Anwesenheit von aktivierendem Mg2+ durch die Hydrolyse des farblosen 4-Nitrophenylphosphats zu Phosphat und 4-Nitrophenol gemessen, das bei alkalischem pH-Wert eine intensiv gelbe Farbe aufweist. Die Bildungsrate des 4-Nitrophenolats bei 37 °C ist der Aktivität der alkalischen Phosphatase proportional und wird kontinuierlich kolorimetrisch über den Absorptionsanstieg bei 405 nm bestimmt. Die Methode ist präzise (VK <1 %), praktikabel und gut mechanisierbar.
Zur Differenzierung der Isoenzyme und Isoformen (s. nachfolgende Tabelle) dienen folgende Methoden:
Differenzielle Inaktivierung durch Hitze (nur Plazenta-AP ist weitestgehend stabil bei 65 °C für 10 Minuten)
Differenzielle Inhibierung durch Inhibitoren wie L-Phenylalanin (hemmt Plazenta- und Intestinal-AP), Lävamisol (hemmt Leber-Knochen-Niere-AP), Homoarginin (hemmt Plazenta- und Intestinal-AP nur gering) u. a.
Nachfolgend sind Inhibitoren der AP-Isoenzyme und -Isoformen zusammengestellt. Die für eine 50 %ige Hemmung unter Standardbedingungen notwendigen Konzentrationen sind angegeben (Harris 1989):
Inhibitor
Gewebeunspezifische AP Leber, Knochen, Niere (mmol/L)
Intestinal-AP (mmol/L)
Plazenta-AP (mmol/L)
L-Phenylalanin
31,0
0,8
1,1
L-Homoarginin
2,7
40,0
>50
Lävamisol
0,03
6,8
1,7
Referenzbereich – Frauen
IFCC-Standardmethode bei 37 °C: 35–104 U/L (0,58–1,74 μkat/L).
Referenzbereich – Männer
IFCC-Standardmethode bei 37 °C: 40–129 U/L (0,67–2,15 μkat/L).
Referenzbereich – Kinder
IFCC-Standardmethode bei 37 °C:
Alter
Männlich
Weiblich
U/L
μkat/L
U/L
μkat/L
0–14 Tage
83–248
1,39–4,14
83–248
1,39–4,14
15 Tage – <1 Jahr
122–469
2,04–7,83
122–469
2,04–7,83
1 Jahr – <10 Jahre
142–335
2,37–5,59
142–335
2,37–5,59
10 – <13 Jahre
129–417
2,15–6,96
129–417
2,15–6,96
13 – <15 Jahre
116–468
1,94–7,82
57–254
0,95–4,24
15 – <17 Jahre
82–331
1,37–5,53
50–117
0,84–1,95
17 – <19 Jahre
55–149
0,92–2,49
45–87
0,75–1,45
Indikation
Diagnose und Identifizierung von Skeletterkrankungen, die primär charakterisiert sind durch eine erhöhte Osteoblasten- und Chondroblastenaktivität
Diagnose hepatobiliärer Erkrankungen mit Gallengangobstruktion und Cholestase durch maligne oder benigne Prozesse
Verlaufskontrolle der Vitamin-D-Substitution bei der Behandlung der Rachitis
Zusatzdiagnostik von malignen Tumoren mit Knochen- und/oder Lebermetastasen
Verlaufskontrolle der Plazentafunktion bei bedrohlichen Trimesterschwangerschaften
Verlaufskontrolle der transitorischen Hyperphosphatasämie bei Kindern
Interpretation
Erhöhungen der AP-Aktivität sind differenzialdiagnostisch bei den in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Erkrankungen und Einflüssen zu berücksichtigen.
Erkrankungen mit veränderter Aktivität der alkalischen Phosphatase im Serum:
Eine Zurückführung der AP-Erhöhung auf das involvierte Organ oder Gewebe ist durch Zusatzbestimmungen weiterer Kenngrößen (z. B. Leucinarylamidase(n), γ-Glutamyltransferase) oder durch Bestimmung von AP-Isoenzymen möglich. Die makromolekulare Heterogenität der AP, insbesondere die an Lipoprotein X gebundene und die partikuläre (membranhaltige) Form, ist bei cholestatischen Lebererkrankungen prominent. Die ektope Expression von Reagan-, Kasahara- und Nagao-Isoenzymen kann als unterstützender Tumormarker bei neoplastischen Erkrankungen differenzialdiagnostisch herangezogen werden.
Für die Bestimmung des knochenspezifischen Isoenzyms (Knochen-AP) steht ein Immunoassay zur Verfügung (Ostasebestimmung).
Literatur
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Rockman-Greenberg C (2013) Hypophosphatasia. Pediatr Endocrinol Rev 10:380–388PubMed
Schumann G et al (2011) IFCC primary reference procedures for the measurement of catalytic activity concentrations of enzymes at 37 °C. Part 9: reference procedure for the measurement of catalytic concentration of alkaline phosphatase. Clin Chem Lab Med 49:1439–1446CrossRefPubMed
