Gen- und „Anti“-Gentherapie in der Onkologie

Sämtlichen Gentherapiemethoden ist der Transfer von rekombinanter Nukleinsäure gemeinsam. Dabei handelt es sich um Gene, die die Expression therapeutischer Proteine zur Folge haben, als auch um Oligonukleotide bzw. RNA, die die Expression bestimmter zellulärer Proteine hemmen.

Die Integration von Nukleinsäuren in Eukaryontenzellen kann durch physikalische, chemische und biologische Methoden erfolgen, sowohl ex vivo als auch in vivo. Bei der Ex-vivo-Methode werden in relativ aufwendiger Weise genmodifizierte Zellen außerhalb des Körpers generiert und anschließend in den Patienten infundiert. Beim In-vivo-Gentransfer hingegen werden die therapeutischen Nukleinsäuren mittels apathogener und vermehrungsunfähiger viraler Vektoren, synthetischer Vektoren oder mittels Lipide lokal oder systemisch intravenös appliziert.

Bei den meisten Gentransfertechniken unterbleibt der Gentransfer der natürlichen Regulationseinheit, stattdessen erfolgt die Kopplung der therapeutischen cDNA mit entsprechenden viralen Promoter-/Enhancersequenzen, um auf diese Weise eine hohe Expression des zu transfizierenden Gens zu erzielen. Dabei unterscheiden sich die Vektoren insbesondere in der Effizienz des Gentransfers, auch der Organotropismus der einzelnen zu verwendenden Vektoren unterscheidet sich deutlich. Beispielsweise werden retrovirale Vektoren aufgrund ihrer relativ hohen Transfektionseffizienz sehr häufig für Gentransfers eingesetzt, auch können sie nicht teilende Zellen befallen und besitzen einen Tropismus für epitheliales Gewebe. Adenoassoziierte Vektoren (AAV) werden beispielsweise an spezifischen Regionen im Chromosom 19 integriert und können dort episomal bis zur ersten Zellteilung verbleiben.

Biologische Gentransfermethoden sind häufig effizienter als die physikalisch-chemischen, auch lassen sich physikalisch-chemische Methoden nicht in vivo anwenden. Bei den biologischen Methoden werden insbesondere virale bzw. synthetische Vektoren verwendet. Da virale Vektoren auf natürlich vorkommenden Viren basieren, eignen sich diese besonders beim In-vivo-Gentransfer aufgrund der natürlich vorkommenden Strategie, die virale Erbinformation effizient in die Wirtszelle einschleusen zu können. Anstatt der viralen Gene transferieren virale Vektoren das gewünschte Gen in Form einer Transgenexpressionskassette mit den jeweiligen Regulationseinheiten in die Zellen.

Zum aktuellen Zeitpunkt zeigt sich die Transfektionseffizienz aktueller Gentransfertechniken jedoch als relativ gering. Aus diesem Grund sind im Rahmen der Therapie häufig sehr hohe Mengen des verwendeten Vektors erforderlich, was zu vermehrten Entzündungs- bzw. Abwehrreaktionen beim behandelten Patienten führt und damit Sicherheitsbedenken hervorruft. Da die Wirkdauer und die Dauer der Genexpression ebenfalls nur begrenzt sind, sind häufig wiederholte Applikation häufig vonnöten, und aufgrund der immunologischen Wirtsreaktion zeigt sich nur eine begrenzte Wirkung. Die Antikörperproduktion gegen virale Vektoren kann eine weitere Applikation unmöglich machen.

Für weitergehende Informationen zu Gentransfermethoden verweisen wir auf Curiel et al. (2000).

CRISPR/Cas9 ist ein Begriff aus der jüngsten Forschungszeit und wurde erstmalig im Jahr 2012 als einzigartige revolutionäre biochemische Technik zum Genome Editing vorgestellt (Jinek et al. 2012). Das Akronym CRISPR steht dabei für „clustered regularly interspaced short palindromic repeats“.

In einer palindromischen Wiederholung ist die Nukleotidsequenz in beiden Richtungen gleich. Auf jede Wiederholung folgen kurze Segmente von Spacer-DNA aus früheren Expositionen gegenüber fremder DNA, wie z. B. von einem Virus oder einem Plasmid. Kleine Cluster von Cas-Genen (CRISPR-assoziiertes System) befinden sich neben CRISPR-Sequenzen. Diese Sequenzen spielen eine Schüsselrolle bei diesem prokaryontischen Abwehrsystem und bilden die Grundlage einer Technologie, die Gene innerhalb von Organismen effektiv und spezifisch verändern kann und die als CRISPR/Cas9 bekannt wurde.

3 Arten von CRISPR-Mechanismen wurden identifiziert, von denen Typ II am besten untersucht ist. In diesem Fall wird eingedrungene DNA von Bakteriophagen oder Plasmiden in kleine Fragmente geschnitten und inmitten einer Reihe von kurzen Wiederholungen in der Größe von etwa 20 Basenpaaren in einen CRISPR-Locus eingebaut. Die Loci werden transkribiert und weiter verarbeitet, um kleine RNA-Fragmente zu erzeugen, die zur Steuerung von Effektorendonukleasen verwendet werden und basierend auf komplementären DNA-Sequenzen gezielt auf eindringende DNA gerichtet werden.

Durch Gen-Knock-down-Experimente konnte ein Cas-Protein – genannt Cas9 – identifiziert werden, das eine Schlüsselrolle bei bestimmten CRISPR-Mechanismen (speziell Typ-II-CRISPR-Systeme) spielt. Der Typ-II-CRISPR-Mechanismus ist einzigartig im Vergleich zu anderen CRISPR-Systemen, da nur ein Cas9-Protein für das Gene Silencing benötigt wird.

Nach Komplexbildung von Cas9 mit einer CRISPR-RNA sowie einer trans-aktivierenden CRISPR-RNA und lokaler Erkennung der spezifischen Virus-DNA erfolgt die Inaktivierung der Ziel-DNA durch spezifische Endonukleasen. Dabei werden Doppelstrangbrüche an bestimmen Stellen erzeugt, die durch eine Zielsequenz von 20 Basenpaaren innerhalb eines assoziierten CRISPR-Transkripts definiert sind. Durch die daraufhin eingeleiteten zelleigenen Reparatursysteme wird der durchtrennte DNA-Strang beispielsweise fehlerhaft zusammengesetzt und das jeweilige lokale Gen somit deaktiviert.

Dieses einfache System der Typ-II-CRISPR-Nuklease mit den nur 3 erforderlichen Komponenten Cas9, CRISPR-RNA sowie und der trans-aktivierenden CRISPR-RNA bildet die Basis für eine gezielte und effektive Genomeditierung. Die Arbeitsgruppe um Jinek et al. entwickelte ein vereinfachtes Zweikomponentensystem durch Kombination der CRISPR-RNA und transaktivierenden CRISPR-RNA zu einer synthetischen Single-Guide-RNA. Auf diese Art und Weise kann eine gezielte Regulation, Reparation, Substitution, Addition oder Deletion von Genen im Rahmen des Genome Editing einfach und effektiv durchgeführt werden.

Es bleibt abzuwarten, welche neuen Therapiemethoden durch die CRISPR/Cas9-Technik möglich sein werden und welche bislang nicht behandelbaren Krankheiten in Zukunft behandelt werden können. Sicherlich hat eine neue Ära im Bereich der Molekularbiologie begonnen. Für weitere Informationen zur CRISPR/Cas9 verweisen wir auf Jinek et al. (2012).

Obwohl Tumorzellen sich von den nichtmalignen Zellen des Körpers unterscheiden, werden sie vom nativen Immunsystem kaum mit ausreichender Effizienz erkannt. Dies lässt sich u. a. zurückführen auf ein zu geringes Expressionsniveau der tumorassoziierten Antigene (TAA) sowie auf das Fehlen kostimulatorischer Moleküle. In Tumorvakzinationsstudien wurde versucht, die natürliche Immunantwort gegen die Tumorzellen v. a. durch Erhöhung der Tumorimmunogenität zu steigern (Guo et al. 2013). Dabei wurden bereits Phase-I- sowie Phase-II-Studien initiiert.

Durch einen Transfer von Genen, die für ein Fremdoberflächenantigen kodieren, in die Tumorzellen kann die Tumorzellimmunogenität gesteigert werden, sodass die Immunantwort sowohl gegen fremde als auch gegen spezifische Tumoroberflächenantigene gerichtet wird. Beispielsweise wurde HLA-B7 als Fremdoberflächenantigen verwendet mit einem signifikanten klinischen Ansprechen bei einzelnen Tumorpatienten.

In anderen Studien konnte gezeigt werden, dass der Transfer von Genen, die für bestimmte Zytokine kodieren, wie z. B. CD80, CD86, CD137L und CD154, durch die Kostimulation von T-Lymphozyten zu einem signifikanten klinischen Ansprechen im Tiermodell führte. Auf der Basis dieser Tiermodelle wurden eine Reihe von klinischen Phase-I- und -II-Studien begonnen. Dabei wurden Patienten autologe Tumorzellen entnommen, in vitro propagiert und transfiziert und anschließend reinfundiert.

In immunkompetenten Patienten wird das Wachstum von Tumorzellen durch multiple Faktoren reguliert, sowohl abhängig als auch unabhängig von der körpereigenen Immunantwort. Tumorzellen beeinflussen aktiv das Immunsystem und können der Immunüberwachung durch die Produktion immunsuppressiver Zytokine entgehen. Mittels Gentherapie kann via Antisense-Oligonukleotide die Expression dieser immunsuppressiver Zytokine unterbunden werden.

Ein Beispiel stellt der „insulin-like growth factor-1“ (IGF-1) dar, der in großen Mengen von unterschiedlichen Tumoren sezerniert wird. Antisense-IGF-1 induzierte im Tiermodell eine immunologische Abstoßung der Tumorzellen durch reduzierte IGF-Produktion. Ferner führte die In-vitro-IGF-Antisense-Behandlung von Gliomzellen zur Apoptose und konnte in vivo mit guter Verträglichkeit angewandt werden (Andrews et al. 2001).

Eine signifikante antitumorale Aktivität von Effektorzellen kann entscheidend zu einer kompletten Tumorremission beitragen. Abgesehen vom bereit angesprochenen Immune-Escape-Mechanismus weisen T-Lymphozyten von Tumorpatienten häufig Fehler wie Zelloberflächendefekte bzw. eine fehlerhafte Signaltransduktion auf. Dies kann trotz Stimulation zu einer ineffektiven Immunantwort führen und somit ein weiteres Tumorwachstum nicht verhindern.

Nicht nur die Tumorzellen selbst, sondern auch T-Lymphozyten als Effektorzellen können Ziel gentherapeutischer Tumortherapiestrategien sein. Beispielsweise kann hierbei die Aktivität der Effektorzellen durch die Expression immunstimulierender Zytokine in vivo erhöht werden, d. h. defekte T-Lymphozyten können auch ohne effektive Signaltransduktion zu einer Reaktion sensibilisiert werden. Ziel der gentherapeutischen Modifikation sind dabei entweder autologe bzw. allogene Tumorzellen oder autologe, allogene bzw. xenogene Fibroblasten, die mit Zytokingenen (z. B. IL-2, IL-4, TNF-alpha, INF-gamma oder GM-CSF) transfiziert und anschließend appliziert werden (Schmidt-Wolf und Schmidt-Wolf 2002). In klinischen Studien mit malignem Melanom und Nierenzellkarzinom konnte mit dieser Therapiestrategie ein klinisches Ansprechen nachgewiesen werden (Schmidt-Wolf und Schmidt-Wolf 1995).

Mit demselben Ziel wurden auch immunologische Effektorzellen wie z. B. tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) oder zytokininduzierte zytotoxische Zellen (CIK) unmittelbar mit Zytokingenen transfiziert. Aufgrund der geringen Gentransfereffizienz bei TIL wurden klinische Studien nicht weiter fortgeführt. Für weitergehende Informationen verweisen wir auf Brenner (2001).

Bei der CAR-T-Zell-Therapie handelt es sich um eine moderne Therapiemethode, die die gentechnisch veränderten Effektorzellen des Immunsystems dazu veranlassen soll, das Immune Editing der Tumorzellen zu überwinden. Somit handelt es sich im engeren Sinne um eine Immuntherapie mit genetisch modifizierten körpereigenen Abwehrzellen. Das Grundprinzip des CAR-T-Zell-Designs – CAR steht dabei für „chimeric antigen receptor“ – beinhaltet rekombinante chimäre Rezeptoren, die spezifische Tumoroberflächenantigen-bindende und T-Zell-aktivierende Funktionen miteinander kombinieren. Dazu werden autologe als auch allogene T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut der Patienten extrahiert und die so veränderten CAR-T-Zellen reinfundiert, um die Tumorzellen spezifisch anzugreifen. Nach der ersten Publikation über CAR-T-Zellen im Jahre 2010 wurden seitdem über 14 weitere Studien veröffentlicht, die viel versprechende Daten zeigen konnten. Inzwischen wurden 2 Präparate in den USA zugelassen, die den CD19-Rezeptor auf Leukämie- und Lymphomzellen erkennen können, und Daten zum CD22-Rezeptor wurden jüngst veröffentlicht. Für weitere Informationen zu CAR-T-Zellen verweisen wir auf Fry et al. (2018).

Antigenpräsentierende Zellen (APC), wie z. B. dendritische Zellen (DC), spielen eine essenzielle Rolle bei der antitumoralen Immunantwort. Durch die Transfektion von Zytokingenen in dendritische Zellen wurde versucht, deren Aktivität zu erhöhen bzw. immunologische Effektorzellen an die dendritischen Zellen heranzuführen. Auch tumorassoziierte Antigene (TAA) können in autologe dendritische Zellen in vitro transfiziert werden, um die zytotoxische Aktivität in vivo zu steigern. Für weitere Informationen verweisen wir auf Weinstock et al. (2017).

Die toxischen Nebenwirkungen einer Chemotherapie sind häufig der Grund für eine Dosisreduktion bzw. Therapieabbruch, was letztendlich immer zu einer unzureichenden und ineffektiven Tumorbehandlung führt. Ein Schutz hämatopoetischer Stammzellen vor den myelotoxischen Nebenwirkungen der Chemotherapie könnte eine höhere Zytostatikadosierung ermöglichen und das Therapieoutcome verbessern. Ein Chemotherapieresistenzgen kann mit einem therapeutischen Gen gekoppelt werden, wie z. B. beim Dihydrofolatreduktase-(DHFR-)Gen zur Erhöhung der tolerablen Methotrexatdosis. Das Enzym DHFR katalysiert die Umwandlung von Folat zu Tetrahydrofolat. Ein weiteres Beispiel ist die Transfektion des Multi-drug-resistance-Gens (MDR 1) mit einer Verminderung der durch Paxlitaxel induzierten Myelosuppression. Für weiterführende Informationen zu Gentherapiestrategien verweisen wir auf Brenner (2001) und Schmidt-Wolf und Schmidt-Wolf (2002).

Durch die zunehmenden Erkenntnisse bei der Onkogenese und die Identifizierung der verantwortlichen Gene bieten sich neue Möglichkeiten, diese Gene als Ziel eines gentherapeutischen Ansatzes zu verwenden. Durch eine Inhibierung der Onkogenexpression kann bei vielen Zelllinien eine Normalisierung der Tumorzellproliferation erreicht werden. Durch den Einsatz von Antisense-Oligonukleotiden und Ribozymen kann die Expression von Onkogenen inhibiert werden.

Unter Antisense-mRNA versteht man eine Einzelstrang-RNA, die komplementär an die mRNA des Onkogens binden kann und diese inhibiert. Somit wird die die Translation und Expression des abnormalen Proteins unterbunden.

Eingesetzt wurden Antisense-Therapien bereits bei unterschiedlichsten malignen Entitäten wie z. B. beim Mammakarzinom, Non-Hodgkin-Lymphom, Ovarialkarzinom und Bronchialkarzinom. Der Einsatz brustgewebespezifischer Vektoren mit Genen für c-fos- sowie c-myc-Antisense-Oligonukleotiden ist zur Behandlung des Mammakarzinoms geplant. Patienten mit K-ras- oder p53-Mutation erhielten eine Injektion mit retroviralem Überstand direkt in einem verbliebenen Lungentumor.

Die Wirksamkeit der Antisense-Methode und eine Inhibition auf das Tumorzellwachstum konnten nachgewiesen werden. In einer Phase-I-Studie mit Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphomen konnte nach täglicher Injektion eines bcl-2-Antisense-Moleküls mehrere Remissionen nachgewiesen werden. Es wurde festgestellt, dass insbesondere eine lokale Antisense-Vektorexpression eine effektive Therapie begünstigt. Die sehr hohen Kosten für die Herstellung der therapeutischen Antisense-Moleküle hinderten bislang den Einzug in die klinische Anwendung. Für weitere Informationen verweisen wir auf Sanders und Hiatt (2005).

Die therapeutische Verwendung von Ribozymen stellt eine weitere Möglichkeit dar, aktivierte Onkogene oder mutierte Tumorsuppressorgene zu deaktivieren. Ribozyme sind kalatytisch aktive RNA-Moleküle und erkennen ihre Zielstruktur durch komplementäre Antisense-Nukleotidsequenzen. Nach Bindung an der RNA kommt es zu sequenzspezifischen Spaltung der RNA-Moleküle durch Aufbrechen der Phosphosäureesterbindung.

Durch die Integrierung von Antisense-Oligonukleotide in die katalytischen Sequenzen von Ribozymen können diese an genau definierbaren Abschnitten der RNA ansetzen. Zudem haben Ribozyme den Vorteil, dass sie unmittelbar nach enzymatischer RNA-Spaltung erneut als Katalysator zur Verfügung stehen. Analog zu den Antisense-Oligonukleotiden können Ribozyme sehr spezifisch konstruiert werden, sodass sie z. B. die mutierte Sequenz eines ras-Onkogens oder eines p53-Tumorsuppressorgens identifizieren und deaktivieren, ohne die Wildtypsequenzen der Gene zu schädigen.

Eine bekannte präklinische Anwendung von Ribozymen stellt die Inaktivierung der bcr-abl-Onkogensequenz bei der chronischen myeloischen Leukämie dar. Ein weiteres Beispiel ist die Anwendung bei zytostatikaresistenten Tumorzellen durch Überexpression des MDR-Gens. Durch die Anwendung MDR1-spezifischer Ribozyme können diese Tumorzellen zytostatikasensibel gemacht werden.

Für weitergehende Informationen zu Ribozymen verweisen wir auf Roth et al. (2014).

Unter dem Begriff der Tumorsuppressorgene werden Gene zusammengefasst, deren Proteine eine inhibierende und regulierende Wirkung auf das Zellwachstum besitzen und eine Apoptose induzieren. Beispiele für Genprodukte der Tumorsuppressorgene sind p53, p21 oder p16. Die Mutation/Deletion eines Tumorsuppressorgens resultiert in abnormalem und überschießendem Zellwachstum und erhöht das Risiko einer malignen Entartung. Das Ziel dieser Therapiemethode ist, die Funktion des Wildtypgens wiederherzustellen.

Die Mutation des p53-Tumorsuppressorgens ist assoziiert mit einer Vielzahl von Tumorerkrankungen, wie z. B. dem Kolon-, kleinzelligen Bronchial-, Ovarial- und Urothelkarzinom sowie bei der B-ALL. Im Tiermodell hat sich der Transfer des p53-Gens bereits als sehr wirksam erwiesen. In klinischen Studien wurde p53 u. a. bei Patienten mit Bronchialkarzinom, intravesikal bei Patienten mit Urothelkarzinom und intratumoral bei Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren angewandt. Nachdem die Veröffentlichung einer klinischen Studie beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom vielversprechende Ergebnisse zeigte, erfolgte die Behandlung weltweit von zwischenzeitlich mehr als 500 Patienten mittels p53-Vektoren.

Aufgrund eines Ansprechens von bis zu 30 % wird in randomisierten Studien geprüft, ob eine Kombination von Chemotherapie in Kombination mit dem rekombinanten humanen Adenovirus-p53 (rhAd-P53) einer alleinigen Chemotherapie bei Kopf-Hals-Tumorpatienten überlegen ist. Während eine Zulassung in Europa und in den USA noch nicht erfolgt ist, wurde in China aufgrund der ermutigenden Resultate in Phase-I- sowie Phase-II-Studien ein replikationsunfähiger adenoviraler p53-exprimierender Vektor als gentherapeutisches Medikament zugelassen (Wilson 2005).

Ein weiterer hochinteressanter neuer Ansatz im Vergleich zu oben genannten Therapiestrategie besteht in der Verwendung replikationskompetenter Adenoviren, die aufgrund eines Verlustes des E1B-Gens – das an das zelluläre Tumorsuppressorprotein p53 bindet und dieses deaktiviert – nicht in gesundem Gewebe, sondern ausschließlich in Tumorzellen, die einen Verlust der p53-Funktion aufweisen, replizieren können.

Unter dem Begriff der Sensitivitätsgene werden Gene zusammengefasst, die relativ harmlose und ungiftige Substanzen in hochtoxische überführen können und letztendlich in den exprimierenden Zellen und häufig auch in den benachbarten Zellen Apoptosen induzieren. Derartige Gene können nach Einschleusung in das Tumorzellgenom innerhalb der Tumorzelle wirken.

Ein sehr gut untersuchtes Suizidgen-System ist das Thymidinkinase/Ganciclovir-System. Hierbei wird das Thymidinkinasegen des Herpes simplex Virus (Typ 1) in Tumorzellen geschleust. Intrazellulär wird das durch dieses Gen kodierte Enzym exprimiert. Die Thymidinkinase katalysiert die Phosphorylierung des Ganciclovir mit einer vielfach höheren Effizienz als die zellulären Thymidinkinasen, sodass Ganciclovir für nicht infizierte Zellen kaum toxisch ist. Nach weiteren Phosphorylierungen durch vorhandene zelluläre Enzyme entsteht Ganciclovirtriphosphat, ein toxisches Molekül, das zur Zerstörung der Tumorzellen führt.

Der Einsatz von Sensitivitätsgenen im Tiermodell führte zu viel versprechenden Resultaten. Culver et al. (1992) konnten komplette Remissionen bei zerebralen Gliomen mit Herpes-simplex-Thymidinkinase-exprimierenden Fibroblasten nachweisen. Der Bystander-Effekt – bei dem benachbarte Tumorzellen ebenfalls zerstört werden – spielt offensichtlich eine große Rolle, da bereits 10–20 % transfizierte Tumorzellen ausreichten, um eine komplette Tumorremission zu erreichen.

Ein weiterer interessanter Ansatz besteht in der Transfektion von Donorlymphozyten mit dem Herpes-simplex-Thymidinkinase-Gen, um eine selektive Elimination von Lymphozyten bei schwerer GVHD nach allogener Stammzelltransplantation zu ermöglichen.

Für weitergehende Informationen zu Anti-Gentherapiestrategien verweisen wir auf Karjoo et al. (2016).

Maligne Zellen benötigen für ihr Wachstum die Tumorangiogenese, um sich im Verlauf mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgen zu können. Ohne Versorgung über das Blutgefäßsystem wachsen solide Tumore nur wenige Millimeter. Daher erscheint die Inhibition der Neovaskularisation eine geeignete Strategie, um das Tumorwachstum zu hemmen.

Angiostatin als proteolytisches Spaltprodukt des Plasminogens besitzt eine inhibierende Wirkung auf die Angiogenese und hemmt damit das Tumorwachstum und die Bildung und das Wachstum von Metastasen. In Tierversuchen konnte eine ausgeprägte Antitumoraktivität von Angiostatin nachgewiesen werden, daher erscheint eine Gentherapie mittels Angiostatin sehr aussichtsreich.