Hämatologische Diagnostik

Die Zytomorphologie ist eine sehr schnelle und preiswerte Methode, die sich für die zumindest orientierende Beantwortung vieler Fragestellungen gut eignet. Besonders häufig ist sie indiziert bei der Abklärung auffälliger Befunde im maschinellen Blutbild (Abb. 1). Für viele hämatologische Entitäten stellt die Zytomorphologie des Knochenmarks nach wie vor den Goldstandard dar (z. B. Diagnose der Myelodysplasien und Subtypisierung der akuten myeloischen Leukämien) (Abb. 2) (Haferlach et al. 2012). Neben der kurzen Untersuchungsdauer und dem niedrigen Preis zählt zu ihren Stärken, dass sie praktisch ubiquitär verfügbar ist. Zu ihren Schwächen zählt, dass es sich um ein wenig sensitives (Sensitivität maximal 1:500) und zugleich sehr erfahrungsabhängiges Verfahren handelt (Löffler und Haferlach 2012).

Die Untersuchungszeit schwankt zwischen wenigen Minuten (orientierende Schnellfärbung) bis einer Stunde (zytochemische Färbungen). Die Kosten liegen zwischen wenigen Euro (Übersichtsfärbung am peripheren Blut) bis etwa 50,- Euro (Spezialfärbungen am Knochenmark).

Bei der Durchflusszytometrie werden zugleich optische (Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht) und immunologische (Immunphänotypisierung) Eigenschaften von Zellen gemessen. Bei der Immunphänotypisierung können sowohl membranständige als auch intrazelluläre Antigene durch fluoreszenzmarkierte Antikörper untersucht werden. Seltener kommen Analysen zum Einsatz, bei denen mit interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen Zellorganellen (z. B. Zellmembran oder DNA) direkt dargestellt werden.

Durchflusszytometrische Untersuchungen kommen insbesondere dann zum Einsatz, wenn zusätzlich zur zytomorphologischen Beurteilung eine immunologische Charakterisierung (entweder zur Bestätigung oder zur weitergehenden Subtypisierung) von Zellen erforderlich ist. Dies ist besonders häufig bei physiologischen oder pathologischen Lymphozyten der Fall, da die morphologische Diversität dieser Zellen weitaus geringer ist, als bei Zellen myeloischen Ursprungs. Darüber hinaus erlaubt die Durchflusszytometrie in manchen Fällen auch semifunktionelle Aussagen, wenn bestimmte immunologische Eigenschaften mit einem bekannten Funktionsdefekt verbunden sind (z. B. Defekt Glycosylphosphatidylinositol(GPI)-verankerter Oberflächenmoleküle bei der paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie, PNH). Das Verfahren erlaubt außerdem, auf den Zellen Zielstrukturen für therapeutische Ansätze (z. B. CD52 für Alemtuzumab oder CD30 für Brentuximab-Vedotin) zu identifizieren und liefert bei einigen Entitäten auch prognostische Informationen (z. B. CD38- oder ZAP70-Expression bei der chronischen lymphatischen Leukämie) (Ortolani 2011).

Zu den Stärken der Durchflusszytometrie zählt, dass sie im Gegensatz zur Zytomorphologie wesentlich objektivierbarer und reproduzierbarer ist. Ferner ist es ein Verfahren, das eine erheblich höhere Sensitivität (ca. 1:10⁴–10⁵) aufweist, weswegen es in gewissem Umfang auch für den Nachweis einer residuellen Resterkrankung („minimal residual disease“, MRD) eingesetzt werden kann. Zu ihren Schwächen zählt, dass die Instrumentierung deutlich aufwendiger und daher weniger verbreitet ist. Ferner ist sie nur begrenzt als Übersichtsmethode geeignet, da lediglich Aussagen bezüglich der untersuchten Antigene gemacht werden können. Die Untersuchungszeit hängt maßgeblich von der Zahl eingesetzter Antikörper und untersuchten Zellen ab und schwankt zwischen etwa 20 Minuten (einfacher Immunstatus) bis einer Stunde (komplexe Charakterisierung neoplastischer Zellen). Die Kosten sind entsprechend unterschiedlich und betragen zwischen ca. 50,- und 500,- Euro.

In den vergangenen Jahrzehnten wurden zahlreiche Chromosomenveränderungen entdeckt, die mehr oder weniger spezifisch mit hämatologischen Krankheiten verbunden sind oder Aussagen über deren Prognose zulassen. Das älteste Beispiel hierfür ist die chronische myeloische Leukämie (CML), für die die Translokation t(9;22)(q34;q11), die u. a. im sog. Philadelphia-Chromosom resultiert, pathognomonisch ist. Weitere entitätsdefinierende Veränderungen sind z. B. die t(15;17)(q22;q12) für die Promyelozytenleukämie oder die t(14;18)(q32;q21) für das follikuläre Lymphom. Neben Translokationen spielen jedoch auch (Teil-)Verluste von chromosomalem Material (Deletionen und Monosomien), Zugewinne (Aneuploidie) oder weitere strukturelle Läsionen (z. B. Inversionen, Isochromosomen, Ringchromosomen) eine Rolle. Beispiel hierfür sind die entitätsdefinierenden Veränderungen del(5q31.1) beim 5q-Minus-Syndrom oder die inv(16)(p13;q22) bei der akuten myelomonozytären Leukämie mit pathologischen Eosinophilen (FAB-Subtyp AML M4eo).

Zusätzlich zur Diagnostik werden zytogenetische Analysen in der Hämatologie für die Prognostik benötigt. Je nach Entität erfolgt eine Risikostratifizierung nach Anzahl und Art von Chromosomenanomalien. Darüber hinaus sind einzelne Aberrationen per se mit einer besonders guten oder schlechten Prognose vergesellschaftet (z. B. t(8;21)(q22;q22) mit günstiger Prognose bei der akuten myeloischen Leukämie mit Differenzierung (FAB-Subtyp AML M2) oder del(17p) mit ungünstiger Prognose bei der chronischen lymphatischen Leukämie).

Methodisch unterscheidet man innerhalb der Zytogenetik zwischen der Karyotypisierung (klassische Chromosomenanalyse), bei der der gesamte Chromosomensatz einer Zelle auf numerische und strukturelle Veränderungen untersucht wird, und der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), bei der nur bestimmte Chromosomenteile analysiert werden.

Für die Karyotypisierung werden in Teilung befindliche Zellen benötigt, die in ihrer Metaphase arretiert werden. Aus diesem Grunde muss der Transport der Proben in das Labor schnell (24–48 h) erfolgen, damit die Zellen rasch in eine 24- bis 72-stündige Kultur genommen werden können, wo sie zur Proliferation angeregt werden. Anschließend werden idealerweise mindestens 20 Metaphasen analysiert.

Die präanalytischen Schritte für eine FISH sind weniger kritisch, da diese Untersuchung an Interphasen erfolgen kann. Der zentrale Punkt ist hierbei die Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden (kurze, einzelsträngige DNA-Moleküle) mit dem chromosomalen Material (Abb. 3). Die FISH ist in Bezug auf die Zellzahl sensitiver, da hier in der Regel mindestens 200 Zellen (Interphasekerne) analysiert werden, und erlaubt auch den Nachweis kleinerer Läsionen, die aufgrund der geringen Auflösung bei der Karyotypisierung verborgen bleiben können. Eine Sonderform der FISH ist die Multicolor-FISH (M-FISH), bei der alle 24 Chromosomen durch unterschiedliche Kombinationen von Farbstoffen spezifisch angefärbt werden. Hierdurch können sehr schwierige und multiple Veränderungen leichter aufgedeckt werden (Abb. 4).

Zu den Stärken der Zytogenetik zählt, dass sie eine gute Übersichtsmethode darstellt und ihr diagnostischer und prognostischer Stellenwert bei vielen Erkrankungen gesichert ist. Zu ihren Schwächen zählt, dass es eine außerordentlich erfahrungsabhängige, arbeitsaufwendige und zeitintensive Methodik ist. Die Untersuchungszeit schwankt zwischen ca. 24 Stunden (FISH-Direktpräparation) und einer Woche (komplexer Karyotyp). Die Kosten liegen zwischen ca. 250,- Euro (einfache Karyotypisierung) und ca. 750,- Euro (M-FISH).

Molekulargenetische Untersuchungstechniken besitzen mittlerweile einen sehr gut etablierten Stellenwert bei der Diagnostik, Prognostik und Verlaufsbeobachtung hämatologischer Erkrankungen. Zum einen basieren sie noch auf konventionellen Polymerasekettenreaktionen (PCR), andererseits werden zunehmend moderne genomische Verfahren eingesetzt, welche die simultane und quantitative Analyse großer Nukleinsäuren bis hin zur vollständigen Untersuchung einer bestimmten Nukleinsäurenart (z. B. Genom, Exom, Transkriptom) erlauben. Aufgrund dieser enormen analytischen Bandbreite, die mit entsprechenden Kosten verbunden ist, muss die Indikation für die Bestimmung verschiedener Parameter sehr sorgfältig gestellt werden. Dessen ungeachtet haben viele molekulargenetische Läsionen Einzug in die Definition von hämatologischen Erkrankungen gefunden. Hierzu zählen z. B. der Nachweis einer V617F-Mutation im JAK2-Gen bei Polycythaemia vera oder die V600F-Mutation im BRAF-Gen bei der Haarzellleukämie. Sofern ein spezifischer molekularer Marker fehlt, kann über die molekulargenetische Techniken in einigen Fällen ein Klonalitätsnachweis bei neoplastischen Erkrankungen erbracht werden. Auch prognostische Parameter kann die Molekulargenetik liefern. Prominente Beispiele hierfür sind Mutationen im Tumorsuppressorgen p53, Hypermutationen im Gen für die variable Immunglobulin-Schwerkette (IgHV) sowie leukämieassoziierte Punktmutationen im Nucleophosmin-1-Gen (NPM1). Mit dem Einzug von immer mehr zielgerichteten Therapien in die Hämatologie nimmt auch die Zahl therapeutisch relevanter Mutationen zu. Hierzu zählt z. B. der Nachweis von Mutationen im chimären BCR-ABL1-Gen bei der CML, die eine partielle oder vollständige Resistenz der Erkrankung auf bestimmte BCR-ABL1-Tyrosinkinaseinhibitoren anzeigen können (Provan und Gribben 2005).

Bis vor Kurzem erfolgte die Sequenzierung nach der Kettenabbruchmethode von F. Sanger. Dieses zuverlässige Verfahren besitzt jedoch den Nachteil, dass nur kleinere Genabschnitte (i. d. R. ca. 500 Basenpaare) mit geringer Sensitivität (ca. 10–20 %) pro Untersuchung analysiert werden können. Moderne Hochdurchsatzverfahren (sog. „next generation sequencing“, NGS) erlauben hingegen die Sequenzanalyse des gesamten Genoms, Exoms oder Transkriptoms mit hoher Empfindlichkeit (bis zu ca. 0,01 %).

Durch ihre hohe Spezifität und Sensitivität besitzen molekulargenetische Verfahren einen herausragenden Stellenwert bei dem Nachweis residueller Resterkrankungen (MRD). Da bei dieser Diagnostik häufig quantitative Verfahren (z. B. Echtzeit-PCR) eingesetzt werden, können bei sequenziellen Untersuchungen auch Aussagen zur Erkrankungsdynamik auf molekularem Niveau getroffen werden (Witt et al. 2009).

Zu den Stärken der Molekulargenetik zählen vor allem die überragende Spezifität und Empfindlichkeit (ca. 1:10⁵–10⁶). Zu den Schwächen zählt, dass sie sich als Übersichtsmethode weniger gut eignet und einen recht hohen Spezialisierungsgrad im Labor erfordert. Die Untersuchungszeit schwankt zwischen ca. zwei Stunden (einfache Untersuchung einer kurzen DNA-Sequenz) bis zu einem Tag (Sequenzierung und Analyse längerer DNA-Abschnitte). Genomische Totalanalysen (NGS) sind noch wenig verbreitet und erfordern derzeit noch mehrere Tage. Die Kosten liegen zwischen ca. 100,- Euro (einfache PCR) und ca. 1000,- Euro (komplexe Sequenzanalyse). Die Kosten für genomische Untersuchungen liegen derzeit noch bei mehreren tausend Euro.

Einige Fragestellungen in der hämatologischen Diagnostik lassen sich mit den vorgenannten Techniken nicht erschöpfend beantworten. Darüber hinaus sind Erkrankungen, die sich außerhalb des hämatopoetischen Systems im lymphatischen oder extralymphatischen Gewebe manifestieren, diesen Analysen kaum oder gar nicht zugänglich. Aus diesem Grunde ist die feingewebliche Untersuchung (Histopathologie) ein fester Bestandteil der Aufarbeitung hämatologischer Erkrankungen.

Für viele hämatologische Entitäten, insbesondere die Lymphome, stellt die Histopathologie den derzeitigen Goldstandard dar. Im Unterschied zur Zytomorphologie überblickt der Pathologe im histologischen Schnitt eine weitaus größere Zahl an Zellen und deren gewebsarchitektonischen Kontext. Auf diese Weise sind z. B. fokale Veränderungen besser zu erkennen, als im Ausstrichpräparat. Darüber hinaus können bei histologischen Untersuchungen zyto- oder immunhistochemische Analysen erfolgen, die über den rein morphologischen Aspekt hinaus eine zuverlässigere Einordnung der Zellen erlauben. Schließlich sind auch molekularpathologische Methoden durchführbar, bei denen durch Hybridisierungsreaktionen qualitative Veränderungen auf Protein- oder Nukleinsäureniveau erkannt werden können.

Zu den Stärken der Histopathologie zählen der sehr gesicherte diagnostische Stellenwert sowie die relativ gute Objektivierbarkeit, ggf. unter Inanspruchnahme spezialisierter Referenzpathologen. Zu den Schwächen zählen die Erfahrungsabhängigkeit des Verfahrens sowie der höhere Zeitaufwand als bei der Zytomorphologie. Die Untersuchungszeit schwankt zwischen wenigen Stunden (Übersichtsfärbung einer Schnellschnittuntersuchung an Weichgewebe) bis mehrere Tage (spezielle Immunhistochemie oder Molekularpathologie an Hartgewebe). Die Kosten liegen zwischen ca. 50,- Euro (Einfachfärbung) und ca. 500,- € (komplexe Spezialfärbungen).